मानचित्रण Ribonucleoproteins के लिए एक रैपिड मानव पूर्व mRNA पर उच्च throughput विधि (RNPs)

Biology

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Summary

पूर्व mRNA की क्षणिक प्रकृति के कारण, यह अलग है और अध्ययन करने के लिए मुश्किल हो सकता है

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Watkins, K. H., Stewart, A., Fairbrother, W. G. A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA. J. Vis. Exp. (34), e1622, doi:10.3791/1622 (2009).

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Abstract

RNAs के अनुक्रमण है कि शाही सेना बंधनकारी प्रोटीन के साथ सह immunoprecipitate (सह आईपी) splicing की हमारी समझ बढ़ गया है कि बाध्यकारी स्थान प्रदर्शन करके अक्सर एक splicing कारक के समारोह को प्रभावित करती है. हालांकि, के रूप में किसी भी नमूने रणनीति के साथ एक एक splicing कारक के लिए बाध्य शाही सेना की पहचान करने का मौका उसके सेलुलर बहुतायत आनुपातिक है. हम अन्यथा पूर्व mRNA क्षणिक पर बाध्यकारी विशिष्टता सर्वेक्षण करने के लिए इन विट्रो दृष्टिकोण में एक उपन्यास विकसित किया है. यह दृष्टिकोण एक विशेष रूप से डिजाइन oligonucleotide पूल का इस्तेमाल कि introns, exons, ब्याह जंक्शनों, या पूर्व mRNA अन्य भर टाइल. पूल आणविक चयन के कुछ प्रकार के अधीन है. यहाँ, हम एक ही है और अनबाउंड अंश में अलग oligonucleotide द्वारा विधि का प्रदर्शन और एक दो रंग सरणी के लिए बाध्य अंश में प्रत्येक oligonucleotide के संवर्धन के रिकॉर्ड की रणनीति का उपयोग. सरणी डेटा अनुक्रम विशिष्ट और संरचनात्मक ribonucleoprotein (RNP) के पूर्व mRNA पर बाध्यकारी determinates की पहचान करने की क्षमता के साथ उच्च संकल्प नक्शे उत्पन्न. इस विधि के लिए एक अनूठा लाभ अपने वर्तमान आईपी और SELEX तकनीकों के साथ जुड़े mRNA की ओर नमूना पूर्वाग्रह से बचने की क्षमता है, के रूप में पूल और विशेष रूप से डिज़ाइन किया गया है पूर्व mRNA अनुक्रम से संश्लेषित. oligonucleotide पूल के लचीलेपन के एक और लाभ यह है के बाद से अध्ययन और टाइल भर experimenter जो क्षेत्रों को चुनता है, अपनी व्यक्तिगत जरूरतों के लिए पूल सिलाई. इस तकनीक का उपयोग, एक बहुरूपताओं या एक बड़े पैमाने पर बंधन या एक कार्यात्मक splicing संवाददाता में पुस्तकालय क्लोन और oligonucleotides कि शामिल अंश में समृद्ध कर रहे हैं की पहचान पर परिवर्तन के प्रभाव को परख कर सकते हैं. इन विट्रो उच्च संकल्प मानचित्रण योजना में इस उपन्यास क्षणिक पूर्व mRNA प्रजातियों, जिसका कम बहुतायत उन्हें vivo में तकनीक में वर्तमान के साथ अध्ययन करने के लिए कठिन बना देता है के साथ RNP बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक अनूठा तरीका प्रदान करता है.

Protocol

पूल डिजाइन और oligo वसूली

  1. पहला कदम पूर्व mRNA पूल डिजाइन करने के लिए अध्ययन किया जा रहा है. यह UCSC जीनोम ब्राउज़र का उपयोग कर और विशेष जीन, ब्याह जंक्शनों, या हित के अन्य क्षेत्रों को डाउनलोड किया जा सकता है है.
  2. एक बार ब्याज की खिड़कियों को चयनित किया गया है, उन्हें भर टाइल computationally निम्नलिखित शर्तों का उपयोग: पढ़ा लंबाई एक 10 nucleotide ओवरलैप करते हैं, इसलिए प्रत्येक oligo से पहले एक 20 nucleotides स्थानांतरित कर दिया है के साथ 30 nucleotides होना चाहिए. * Oligo ओवरलैप ब्याह साइटों के लिए निकटता में वृद्धि की जानी चाहिए पर्याप्त कवरेज सुनिश्चित करने, 10 से 20 nucleotides से ओवरलैप में वृद्धि इस हासिल कर सकते हैं.
  3. पार्श्व सार्वभौमिक प्राइमर दृश्यों, जो पूल बहाव बढ़ाना इस्तेमाल किया जाएगा के साथ प्रत्येक oligo 30 nucleotide. टाइलों oligo आदेश Agilent है, जहां अनुक्रम एक कस्टम oligonucleotide माइक्रोएरे पर मुद्रित किया जाएगा प्रस्तुत किया जाना चाहिए.
  4. एक सरणी संकरण कक्ष में सरणी कवर स्लाइड स्लाइड पर रखने और धीरे DH 2 हे 500 μL pipetting द्वारा माइक्रोएरे की सतह से डीएनए oligos ठीक करने के लिए शुरू
  5. सैंडविच कवर स्लाइड के शीर्ष पर सरणी, देखभाल लेने के लिए हवाई बुलबुले कि प्रक्रिया को बाधित कर सकते हैं से बचने के. सरणी चेहरा जगह नीचे ताकि oligos पक्ष के साथ पानी की सतह को छू रहा है सुनिश्चित करें. अंगूठे का एक अच्छा शासन "Agilent छू Agilent है" जिसका अर्थ है कि सरणी पर Agilent के लेबल कवर स्लाइड पर Agilent के लेबल चेहरे
  6. संकरण चैम्बर बंद और 99 ° सी में एक संकरण ओवन में रात भर बारी बारी से
  7. अगले दिन, ध्यान कक्ष से सरणी को हटाने और बंद पानी है, जो अब शामिल oligos सरणी सतह से मुक्त आकर्षित. यह oligo पूल है
  8. एक 1.5 एमएल Eppendorf ट्यूब में पूल प्लेस और 3-5 दूसरा दालों के लिए 50% आयाम पर पूल sonicate
  9. अगले, कम चक्र पीसीआर द्वारा पूल बढ़ाना, एक T7 को समाप्त करने के लिए संलग्न टैग के साथ सार्वभौमिक प्राइमरों का उपयोग. पहली, 94 दौर denature ° सी 1 मिनट के लिए, 20 सेकंड के लिए 55 ° सी में पानी रखना, और 72 में 1 मिनट के लिए बढ़ाना डिग्री सेल्सियस बाद के दौर के लिए 10 सेकंड, 20 सेकंड और 10 सेकंड प्रत्येक संबंधित तापमान 72 पर 5 मिनट के अंतिम बढ़ाव कदम डिग्री सेल्सियस के साथ, क्योंकि पूल बढ़ाना आवश्यक चक्र की संख्या oligo वसूली की दक्षता पर निर्भर करता है, यह करने के लिए कई चक्र संख्या की कोशिश करने के लिए आवश्यक हो सकता है. पूल, जो एक acrylamide जेल पर लिप्त बैंड से signified है नहीं से अधिक बढ़ाना करने के लिए सावधान रहें. पीसीआर प्रवर्धित नमूने 4 में संग्रहीत किया जा सकता डिग्री सेल्सियस जब तक की जरूरत है.
  10. oligo तैयारी अंतिम चरण में शाही सेना नक़ल Ambion से MEGAshortscript ™ किट का उपयोग करने के लिए है. * निम्न प्रोटोकॉल Ambion से अनुकूलित किया गया है.
    1. जबकि बर्फ पर T7 एनजाइम मिक्स रखने T7 10x बफर रिएक्शन, चार ribonucleotide समाधान और कमरे के तापमान पर पानी पहले गला लें
    2. कमरे के तापमान पर एक RNase मुक्त microcentrifuge ट्यूब में प्रतिक्रिया मिश्रण इकट्ठे. प्रतिक्रिया बफर के घटक वेग टेम्पलेट डीएनए कारण अगर प्रतिक्रिया बर्फ पर मिश्रित कर सकता है.
    3. निम्नलिखित क्रम में, 3 विंदुक μL पानी nuclease मुक्त, 10x प्रतिक्रिया बफर के 2 μL, प्रत्येक 75 मिमी NTP समाधान के 2 μL टेम्पलेट डीएनए के 5 μL (पीसीआर प्रवर्धित oligo पूल) और T7 एंजाइम के 2 μL के लिए, 20 μL के अंतिम मात्रा
    4. ट्यूब धीरे झाड़ प्रतिक्रिया तो संक्षिप्त करने के लिए ट्यूब के नीचे मिश्रण इकट्ठा microfuge मिश्रण.
    5. 37 ° 2 घंटे के लिए सी thermocycler में प्रतिक्रिया सेते हैं. ऊष्मायन समय टेम्पलेट पर निर्भर हो सकता है, इसलिए यह आवश्यक हो सकता है एक समय बेशक प्रयोग का उपयोग करने के लिए अधिक से अधिक उपज के लिए इष्टतम ऊष्मायन समय निर्धारित कर सकते हैं
    6. 2 घंटे के बाद, प्रतिक्रिया और 37 पर सेते टर्बो DNase का 1 μL जोड़ने ° सी द्वारा एक अतिरिक्त 15 मिनट के लिए टेम्पलेट डीएनए निकालने
    7. बर्खास्त प्रतिक्रिया और phenol / क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और इथेनॉल वर्षण द्वारा शाही सेना को ठीक.
      1. एक 20 μL प्रतिक्रिया मात्रा के लिए, DH हे 2 115 μL और 3 एम सोडियम प्रतिक्रिया के लिए एसीटेट के 15 μL जोड़ें .
      2. अच्छी तरह से तो मिक्स क्लोरोफॉर्म की अम्लीय phenol और 75 μL के 75 μL जोड़ने. मिश्रण vortexing द्वारा समाधान है, तो कमरे के तापमान पर 13,000 rpm पर एक मिनट के लिए microfuge. एक नया ट्यूब जलीय परत स्थानांतरण और निष्कर्षण दोहराने
      3. एक नया ट्यूब जलीय परत स्थानांतरण और क्लोरोफॉर्म की 150 μL जोड़ें. भंवर और पहले के रूप में मिश्रण अपकेंद्रित्र. एक नया ट्यूब जलीय परत स्थानांतरण.
    8. जलीय परत करने के लिए 100% ठंड इथेनॉल के दो संस्करणों को जोड़ने और मिश्रण अच्छी तरह से शाही सेना पुनर्प्राप्त. -20 पर 15 मिनट की एक न्यूनतम के लिए मिश्रण चिल डिग्री सेल्सियस तो 4 बजे अपकेंद्रित्र ° सी अधिकतम गति पर गोली शाही सेना के लिए 15 मिनट के लिए. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने और 0.1x बफर Tris - EDTA (ते) के 105 μL में गोली resuspend ..
  11. T7 किट प्रतिक्रिया से मुक्त nucleotides के सभी निकालते हैं, तो सबसे सटीक परिणाम के लिए, RiboGreen का उपयोग शाही सेना यों यह मुश्किल है.
    1. Quantitation शुरू करने के लिए, पहले पर्याप्त 1x ते पतला, 2300 μL + 50μL/sample.
    2. अगला, RiboGreen बनाते हैं. आप 1000 की आवश्यकता होगी μL + 50 μL / नमूना. उच्च श्रेणी के लिए नमूने (1 μg / एमएल से 20 एनजी / एमएल) 1x ते में RiboGreen 1:200 मिश्रण, कम रेंज के नमूने के लिए (50 एमएल / एनजी के लिए 1 एनजी / एमएल) 1x ते में RiboGreen 1:2000 मिश्रण , एक अपारदर्शी प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से में 50 RiboGreen समाधान के μL, A1: के साथ शुरू और नीचे जाने, नहीं भर पिपेट
    3. एक शाही सेना शेयर 2 μg / उच्च श्रेणी के नमूने या 100 एनजी / कम रेंज के नमूने के लिए μL के लिए एमएल समाधान पतला
    4. शेयर समाधान का प्रयोग, छह मूल 2 μg / एमएल या 100 शेयर एनजी / एमएल के बाद 01:02 dilutions द्वारा एक मानक वक्र बनाने, पिपेट एक पीसीआर पट्टी ट्यूब में 240 शेयर की μL. शेष 7 ट्यूबों में, पिपेट 1x ते के 120 μL. शाही सेना स्टॉक से 120 μL अच्छी तरह से ले लो, और 2 ट्यूब के साथ मिश्रण. 2 ट्यूब से 120 μL ले लो और 3 ट्यूब के साथ मिश्रण. 7 ट्यूब जब तक दोहराएँ. 8 ट्यूब केवल ते है और अपने खाली हो जाएगा. पिपेट अपारदर्शी थाली, A1: में 50 मानक वक्र के समाधान के μL: H2 (वक्र दो बार से चलाएँ)
    5. एक नया ट्यूब, ते के 45 μL oligo पूल के 5 μL के साथ मिश्रण और एक अच्छी तरह से है कि RiboGreen के 50 μL शामिल सभी 50 μL जोड़ने.
    6. एक प्लेट रीडर का उपयोग करना मशीन सेट 485 एनएम और 530 एनएम के तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन की एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ एक मिश्रण एक मिनट के बाद ऊपर से प्रतिदीप्ति पढ़ सकते हैं और थाली को पढें
    7. मानक बरामद शाही सेना यों उत्पन्न वक्र है, जो -20 ° सी. पर संग्रहित किया जाना चाहिए का उपयोग करें

ब्याज की एक RNP के साथ oligo पूल के सह - immunoprecipitation

  1. सह - immunoprecipitation शुरुआत करने से पहले करने के लिए, उन्हें एक 1:1 के अनुपात में मिश्रण प्रतिक्रिया प्रति 50 μL के अंतिम मात्रा करने के लिए एक और प्रोटीन Invitrogen से Dynabeads जी प्रोटीन तैयार. उदाहरण के लिए, दो प्रतिक्रियाओं के लिए आप 50 μL प्रत्येक मनका के प्रत्येक जोड़ना होगा.
  2. Novagen से यह एक तरह एक चुंबकीय पृथक्करण स्टैंड का उपयोग जगह में मोती पकड़ जबकि आप सतह पर तैरनेवाला हटाने और धोने मोती ठंड 1x पीबीएस के एक समान मात्रा के साथ दो बार
  3. दूसरा धोने के बाद, ठंड 1x पीबीएस के एक बराबर मात्रा में मोती resuspend और प्रतिक्रिया प्रति एंटीबॉडी के 2 एनजी जोड़ें. इस राशि एंटीबॉडी के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, तो प्रयोग इष्टतम स्थितियों को खोजने के लिए आवश्यक है.
  4. 4 में मिश्रण / मनका एंटीबॉडी रातोंरात सेते ° एक घूर्णन मंच पर सी
  5. सुबह में, sonicated खमीर कुल शाही सेना की प्रतिक्रिया गैर विशिष्ट बंधन ब्लॉक 2 प्रति μg जोड़ने के लिए, और एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए बारी बारी से 4 बजे डिग्री सेल्सियस
  6. चुंबकीय रैक का उपयोग करने के लिए मोती पकड़ सतह पर तैरनेवाला हटायें और मोती धोने ठंड 1x पीबीएस के साथ दो बार, ट्यूब में दूसरा धोने से पीबीएस छोड़ने.
  7. नए ट्यूबों, प्रत्येक और प्रत्येक ट्यूब में विभाज्य मनका मिश्रण के 50 μL प्रतिक्रिया के लिए ले लो. मोती बैठते हैं, जबकि एक मास्टर मिश्रण की तैयारी
  8. के लिए प्रत्येक प्रतिक्रिया oligo पूल के 200 एनजी, संरक्षण प्राइमरों की एक equimolar अनुपात, sonicated खमीर कुल शाही सेना के 2 μg HeLa परमाणु निकालने (इस RNP स्रोत है) के 20 μL, और बफर ई जोड़ने से 120 मात्रा को लाने μL. सुरक्षा प्राइमरों सार्वभौमिक प्राइमरों की शाही सेना संस्करणों रहे हैं. आदेश एक T7 को समाप्त करने के लिए संलग्न टैग के साथ सार्वभौमिक प्राइमरों के प्रतिलेखन टेम्पलेट्स, तो नक़ल MEGAshortscript ™ किट का उपयोग कर टेम्पलेट्स से शाही सेना.
  9. मनका मास्टर मिश्रण के 120 μL में aliquots resuspend मोतियों से सतह पर तैरनेवाला निकालें. प्रतिक्रियाओं 4 बजे ° 1-2 घंटे के लिए सी रॉक.
  10. ऊष्मायन के बाद, प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, एक "कुल" शाही सेना नमूना के लिए एक छोटे से विभाज्य (मोती सहित) को हटाने
  11. चुंबकीय जुदाई स्टैंड पर प्रतिक्रियाओं की शेष प्लेस और सतह पर तैरनेवाला हटायें. यद्यपि यह आवश्यक नमूना बहाव के माध्यम से प्रवाह इस का विश्लेषण नहीं है, इसे बचाने के लिए उपयोगी हो सकता है.
  12. मोती ठंड 1x पीबीएस के 50 μL के साथ 1-2 बार धोएं. मनकों पर एंटीबॉडी के लिए बाध्य शाही सेना "आईपी" नमूना है.
  13. एसडीएस 0.1x ते बफर में 1% की 50 μL में "कुल" और "आई पी" मोती Resuspend और 65 में नमूने गर्मी डिग्री सेल्सियस 15 मिनट के लिए शाही सेना elute करने के लिए.
  14. निकालें सतह पर तैरनेवाला है, जो अब शाही सेना है कि पहले मोतियों के लिए बाध्य किया गया था और phenol / क्लोरोफॉर्म एक इथेनॉल वर्षण द्वारा बाद निष्कर्षण द्वारा साफ होता है. गोली सूखी और यह 50 μL 0.1x ते बफर में resuspend.

रिवर्स और aminoallyl लेबलिंग के लिए तैयारी में सह आईपी नमूने के प्रवर्धन प्रतिलेखन

  1. अगला, शाही सेना के नमूने रिवर्स लिखित और पीसीआर परिलक्षित होना चाहिए. रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के लिए, रिवर्स सार्वभौमिक प्राइमरों का उपयोग करें.
  2. प्रत्येक नमूने के लिए, 1 के μL मिश्रण से शुरूटेम्पलेट शाही सेना के एक μL के साथ रिवर्स सार्वभौमिक प्राइमर, (immunoprecipitation प्रतिक्रिया से) और DH 2 ओ के 10 μL 70 में सी. ° सी के 5 मिनट के लिए तो बर्फ पर ठंड या 4 में रखने ° प्रतिक्रियाओं हीट
  3. जबकि शांत नमूने, निम्न मास्टर मिश्रण बनाते हैं. प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए 10 मिमी dNTPs 4 μL, 10x Arrayscript बफर के 2 μL, 1 μL RNase अवरोध करनेवाला, और 1 μL रिवर्स प्रतिलेखन एंजाइम गठबंधन. अच्छी तरह मिक्स और प्रत्येक रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के लिए मास्टर मिश्रण के 8 μL जोड़ें.
  4. एक पीसीआर मशीन का प्रयोग के लिए 42 ° सी में 2 घंटे के लिए नमूने सेते 95 द्वारा पीछा ° सी, 5 मिनट के लिए तो 4 डिग्री सेल्सियस तक नमूने प्रवर्धन के लिए की जरूरत है.
  5. रिवर्स आरएनए नमूने transcribing के बाद, पीसीआर उन्हें बढ़ाना सार्वभौमिक प्राइमरों का उपयोग कर एक T7 टैग युक्त प्राइमरों के साथ. के लिए पूल बढ़ाना की जरूरत चक्र की संख्या सह आईपी की दक्षता पर निर्भर है तो यह कई चक्र की कोशिश आवश्यक हो सकता है. प्रत्येक प्रतिक्रिया 10x Taq प्रतिक्रिया बफर, प्रत्येक प्राइमर (100 मिमी), 1 सीडीएनए टेम्पलेट की μL (रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया से), 10 मिमी dNTPs के 1 μL, DH 2 हे 42.2 μL 0.2 μL के 5 μL की आवश्यकता है, और Taq एंजाइम की 0.4 μL.

    पीसीआर 94 ° C पर 3 मिनट के लिए नमूने incubating द्वारा शुरू करो. अगला, प्रत्येक चक्र denature, 94 पर के लिए ° सी 45 सेकंड के लिए, 55 में पानी रखना ° C 30 सेकंड के लिए, और एक मिनट के लिए 72 ° C से 72 ° C पर 10 मिनट के लिए एक अंतिम बढ़ाव के साथ बढ़ाना.
  6. अगला, नमूनों को फिर से नक़ल MEGAshortscript ™ किट का उपयोग कर, लेकिन, इस समय aminoallyl UTP के 2 μL जोड़ने के लिए, बजाय T7 UTP. aminoallyl UTP Cy रंगों के साथ शाही सेना लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
  7. Phenol / क्लोरोफॉर्म और इथेनॉल नमूने वेग. Glycoblue या अमोनियम एसीटेट का उपयोग नहीं है, जो दोनों के नमूनों की सरणी के लिए संकरण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. 4.5 0.1 एम सोडियम कार्बोनेट की μL में गोली और resuspend सूखी.

Cy रंगों के साथ एमिनो एलिल शाही सेना की लेबलिंग

  1. शुरू करने के लिए लेबलिंग प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट रंजक, और cy5 cy3 प्रत्येक DMSO के 45 μL में भंग. प्रकाश से बचने, और -20 डिग्री सेल्सियस पर एल्यूमीनियम पन्नी की दुकान में अंधेरे में ट्यूबों लपेट
  2. नमूने शाही सेना और मिश्रण अच्छी तरह से nuclease मुफ्त पानी के 2.5 μL जोड़ें
  3. अगला, "आईपी" नमूना 3 Cy3 का "कुल" नमूना μL, और μL 3 के Cy5 जोड़ें. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए अंधेरे में नमूने सेते हैं, नमूना Cy-3 लाल या गुलाबी बारी जबकि Cy-5 नीले बंद हो जाएगा.
  4. प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए, प्रत्येक नमूना के लिए 4 एम hydroxylamine - एचसीएल के 6 उल जोड़ने, मिश्रण अच्छी तरह से और संक्षेप में स्पिन. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं.
  5. Phenol / क्लोरोफॉर्म 0.1x ते का 50 μL में इथेनॉल वर्षण और resuspend गोली द्वारा पीछा निष्कर्षण द्वारा लेबल नमूने शुद्ध

Agilent ऐरे संकरण किट का उपयोग माइक्रोएरे के लिए नमूने संकरण

  1. धीरे 10x बफर अवरुद्ध, के μL nuclease मुक्त H2 हे, Cy3 लेबल "कुल" पूल, Cy5 लेबल "आईपी" पूल के 25 μL के 25 μL, 10 के 140 μL के 50 μL के मिश्रण से संकरण शुरू 25x विखंडन बफर और 2x संकरण बफर के 250 μL, बुलबुले शुरू से बचने के ख्याल रख रही. संक्षेप में ट्यूब के नीचे समाधान में इकट्ठा करने के लिए और भी बुलबुले को कम नमूना Microfuge.
  2. O-अंगूठी संकरण कक्ष में कवर स्लाइड प्लेस और ध्यान से स्लाइड पर समाधान विंदुक.
  3. कवर समाधान "सैंडविच" के लिए स्लाइड के शीर्ष पर पता लगाने सरणी रखें. पूरबी सरणी स्लाइड करने के लिए याद रखें इतना है कि सरणी पर Agilent के लेबल कवर स्लाइड पर Agilent के लेबल चेहरे.
  4. संकरण कक्ष में सैंडविच / स्लाइड सरणी दबाना और 3 घंटे के लिए 50 ° C पर बारी बारी से.
  5. जबकि सरणी rotating है, 50-एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में निम्नलिखित 50 एमएल समाधान बनाने: एक शंक्वाकार DH 2 हे, दो 1x SCC बफर समाधान, प्रत्येक एक अलग ट्यूब में है, और एक 2x SCC बफर के 50 एमएल के साथ भर दिया .
  6. तीन घंटे की ऊष्मायन के बाद, ध्यान से सैंडविच / सरणी स्लाइड unclamp और 50 एमएल 2x SCC बफर युक्त शंक्वाकार में यह जगह. चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग, धीरे कवर स्लाइड से सरणी अलग और बाहर खींच कवर स्लाइड. सरणी के रूप में स्लाइड से बाहर खींच लिया है स्पर्श नहीं सावधान रहो. शंक्वाकार बंद करें और धीरे से 60 सेकंड के लिए पलटना.
  7. चिमटी का प्रयोग, 1x SCC समाधान के लिए सरणी हस्तांतरण, ट्यूब, टोपी और धीरे से 1 मिनट के लिए तो पलटना दूसरा 1x SCC समाधान के लिए सरणी हस्तांतरण और फिर धीरे से एक मिनट के लिए पलटना.
  8. अन्त में, DH 2 हे की ट्यूब को सरणी के स्थानांतरण और धीरे से 30 सेकंड के लिए पलटना.
  9. Kimwipe पर स्लाइड के किनारों रखकर सरणी सूखी. पर सरणी बारी बारी से करने के लिए जारी रखें oligos युक्त पक्ष को बाधित नहीं करने के लिए सुनिश्चित बनाने पोछ लो.
  10. में सूखी सरणी प्लेसएक खाली 50-एमएल शंक्वाकार और एक माइक्रोएरे स्कैनर के साथ ट्यूब स्कैन

माइक्रोएरे की व्याख्या

  1. माइक्रोएरे स्कैनर सरणी के एक TIF छवि पैदा करेगा. Agilent फ़ीचर निष्कर्षण सॉफ्टवेयर के माध्यम से इस छवि को चलाने के ग्रिड (Agilent के द्वारा आपूर्ति की) फ़ाइल जो आपके विशिष्ट पूल करने के लिए अद्वितीय है का उपयोग कर.
  2. Agilent सॉफ्टवेयर प्रत्येक सुविधा पर संकेत व्याख्या करने के लिए एक फ़ाइल है, जो एक पर्ल स्क्रिप्ट के साथ पार्स है पैदा करेगा. प्रत्येक सुविधा पर संकेत उस चैनल पर कुल तीव्रता के लिए सामान्य है. हरी चैनल में एक विशेष सुविधा पर उदाहरण के लिए, व्यक्तिगत सुविधा के लिए ग्रीन चैनल की तीव्रता सभी सुविधाओं पर हरे चैनल की कुल तीव्रता से विभाजित है. अंतिम आउटपुट सरणी पर प्रत्येक सुविधा पर हरे चैनल पर लाल चैनल के लॉग अनुपात है.
  3. माइक्रोएरे से oligo पूल डेटा किया जा सकता है जीनोम को वापस फिर से मैप करने के लिए जहां एक तस्वीर मिल, और दृढ़ता से कैसे ब्याज की RNP बाध्य.

चित्रा 1. प्रायोगिक योजनाबद्ध

चित्रा 1a
योजना खपरैल का छत. चयन और ब्याज की पूर्व mRNA दृश्यों डाउनलोड करने के बाद, क्षेत्र का चयन के माध्यम से 30 nucleotide खिड़कियों कि 10 nucleotide वेतन वृद्धि में बदलाव में टाइलों है. यूनिवर्सल प्राइमर बाध्यकारी साइटों पार्श्व खिड़की के प्रत्येक पक्ष.

चित्रा 1b
बी संश्लेषण ऐरे. टाइलों oligo आदेश Agilent है, जहां अनुक्रम एक कस्टम oligonucleotide माइक्रोएरे पर मुद्रित किया जाएगा प्रस्तुत किया जाना चाहिए.

चित्रा -1 सी
सी. सह - immunoprecipitation. सरणी बंद oligos उबलते के बाद, HeLa परमाणु निकालने में सेते हैं, तो चुंबकीय मोती है कि ब्याज की RNP के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ तैयार कर रहे हैं के लिए निकालने जोड़ने. लेबल शुरू Cy3 साथ oligo पूल और Cy5 के साथ ही आईपी पूल और पता लगाने सरणी और स्कैन करने के लिए लागू होते हैं.

चित्रा 2. साथ जीनोम और संवर्धन डेटा के विश्लेषण annotating.

चित्रा 2
अ. कन्वर्ट सरणी डेटा से प्रत्येक जीनोमिक समन्वय पर औसत स्कोर के आधार दस लॉग करने के लिए और नक्शे है कि स्कोर दिया निर्देशांक. इस औसत कदम का एक उदाहरण 3 2 के स्कोर, 4, और 0.5, जहां प्रत्येक विंडो 10-NT के लिए औसत संवर्धन स्कोर ऊपर रेखांकन है के साथ 30-NT के oligos अतिव्यापी के लिए दिया जाता है. चयनित जीनोमिक क्षेत्रों USCS जीनोम ब्राउज़र में कस्टम ट्रैक का उपयोग visualized किया जा सकता. उदाहरण ब्राउज़र विंडो दी clta जीन, जहां जीन की विशेषताएं (exons / introns / वैकल्पिक splicing आदि) और PTB बाध्य oligos से नीचे लॉग औसत संवर्धन स्कोर के साथ दिया जाता है गहरे लाल ऊर्ध्वाधर सलाखों के द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं में है. PTB जोरदार polypyrimidine पथ में सिर्फ 2 एक्सॉन के ऊपर बांध.

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Discussion

जब यह प्रक्रिया कर रही अपनी महत्वपूर्ण है कि पूल के निर्माण को याद या तो शाही सेना या प्रोटीन के स्तर पर लचीला और संशोधन के लिए खुला है. शाही सेना के स्तर पर orthologous क्षेत्रों, रोग म्यूटेशनों, बहुरूपताओं, या यादृच्छिक म्यूटेशनों oligonucleotide अनुक्रम में पेश किया जा सकता है. प्रोटीन के स्तर पर शाही सेना बाध्यकारी कारक phosphorylation या अन्य पोस्ट translational संशोधनों के द्वारा संशोधित किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, बाध्यकारी पर्यावरण या तो वृद्धि या अतिरिक्त कारकों है कि बातचीत या ब्याज की शाही सेना बंधनकारी प्रोटीन के साथ प्रतिस्पर्धा के स्तर में कमी करने के लिए चालाकी से किया जा सकता है.

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