Author Produced

Спинной мозг электрофизиологии

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Демонстрация изоляции новорожденных мышей спинного мозга для электрофизиологических исследований.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology. J. Vis. Exp. (35), e1660, doi:10.3791/1660 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Новорожденных мышей спинного мозга представляет собой модель для изучения развития нейронных схемотехника и опорно-двигательного движения. Мы показываем, спинного мозга и рассечение подготовке записи ванны искусственного спинномозговой жидкости используются для опорно-двигательного исследований. После рассеченные, спинного мозга вентральной нервных корешков может быть присоединен к записи электродов для записи электрофизиологических сигналов центральной схемы создания картины в поясничном мозга.

Protocol

1. Подготовка искусственной цереброспинальной жидкости (aCSF) 1. Мы сначала подготовить 2 л 10X запас aCSF без магния и кальция. Реагенты, перечисленные в миллимолярных. Каталог цифры относятся к Sigma / Aldrich.

2 литра 10X aCSF (без Mg или Ca)
Реагент мМ g/2L Каталог
KCl 40 5,96 P-9333
NaCl 1280 149,61 S-7653
NaHCO 3 210 35,28 S-6297
NaH 2 PO 4 5 1,38 S-9638
Глюкоза 300 108,12 D-9434
Добавить дистиллированной водой до 2 л

Мы также будем готовить 1М растворов MgSO 4 и CaCl 2 в 50 мл воды, чтобы обеспечить корректировку молярность от эксперимента к эксперименту и обеспечить кальция остается в растворе.

1M кальция и магния Акции
Реагент М g/50mL Каталог
CaCl 2 1 7,35 C-5080
MgSO 4 1 12,33 M-5921

Решение aCSF должны быть отравлены газом с карбогена (95% О2 / 5% СО2), чтобы снизить рН перед добавлением кальция или кальция будет выпадать в осадок.

1 литр aCSF
Реагент Объем
10X aCSF 100 мл
1М CaCl 2 1 мл (рассечение) 2 мл (запись)
1M MgSO 4 1 мл
Добавить ~ 800 мл дистиллированной воды, газа с карбогена в течение 2 минут перед добавлением кальция
Добавить дистиллированной водой до 1 л.

Насосы и насосно-компрессорные и рассекает блюда должны быть промыты до и после использования.

Рассечение

Хотя рассекает, 1мМ кальция aCSF следует постоянно газом с карбогена. ACSF можно перекачать из бутылки рассекает блюдо и перекачивается из рассекает блюдо к бутылке или отправлены в отходы. Мы используем эластомер (Sylgard, Dow Corning), покрытых блюдо выполнить рассечение.

Новорожденных мышей быстро обезглавленный с острыми ножницами и разрез, сделанный с помощью ножниц по вентральной грудной клетки и живота. Животное тогда потрошился. Потрошился мыши промывается aCSF. Животное тогда возлагали на вскрытии блюдо с насекомыми контактов вводится через передние конечности и у основания хвоста.

Позвоночника снимается, выполняя вентральной ламинэктомия. Позвоночника проводится с небольшими щипцами и один лезвие маленькие ножницы вставляется спины сразу костлявые позвоночника. Пластинки разрезается на одной стороне, а затем другие, мягко подъема костлявые позвоночника. Это осуществляется по длине позвоночника.

Спинного мозга удаляется путем разрезания вдоль обеих сторон спинного мозга разорвать корешки спинномозговых нервов и сократить мозговых оболочек окружающих спинной мозг. Режем на левой и правой сторон, то мы сократим мозговые оболочки прикреплен к спинной стороне спинного мозга, чтобы освободить его. Изолированных шнур затем возлагали на блюдо рядом с входом aCSF для обеспечения хорошей оксигенации, если дополнительные животные расчленены.

Изолированных спинного мозга, затем переведен в записи блюдо с помощью небольшого ложкой или лопаточкой. Здесь мы заливать препарат с кислородом кальция 2 мМ aCSF. Спинной мозг прижат к эластомера покрытием блюдо и микроманипуляторами используются для перемещения внеклеточной, целые электродов всасывания корневого возле корней. Когда электрод находится вблизи свободного конца корня, нежное всасывание применяется привлечь внедряются в всасывающего электрода. Этот процесс может быть повторен для записи несколько корней одновременно.

Рисунок 1
Рисунок 1. Обезглавливание и Evisceration. A. Быстро обезглавить мышь с острыми ножницами. Больше или меньше взносов ствола мозга может быть достигнуто в зависимости от уровня среза. B. Место один лезвие ножниц в отверстие грудной полости созданные обезглавливание. Открытое вентральной грудной клетки и брюшной полости до основания хвоста. Удалите внутренности и промыть aCSF.

Рисунок 2 Рисунок 2. Удаление позвоночника. A. Вставьте левый лезвие ножниц в пространство между позвоночника и спинного мозга справа от спинного мозга и прорезают кости прокладки брюшной части мозга. Затем вставьте право лезвие ножниц в пространство между позвоночника и спинного мозга, слева от спинного мозга и разреза. Б. Повторите эту процедуру при применении нежной тяги к позвоночнику. Будьте осторожны, не прокол спинного мозга, держа ножницы под небольшим углом.

Рисунок 3
Рисунок 3. Удаление спинного мозга. A. Вставьте левый лезвие ножниц в пространство между спинным мозгом и кости справа от спинного мозга и прорезать корешков спинного мозга и мозговых оболочек прокладки сбоку от мозга. Затем вставьте право лезвие ножниц в пространство между спинным мозгом и кости слева от спинного мозга и прорезать корешков спинного мозга и мозговых оболочек прокладки сбоку от мозга. B. Наконец, осторожно поднимите ростральной мозга и мозговых оболочек вырезать подключения спинной мозг к пластинок. Снова старайтесь не прокол спинного мозга, держа ножницы под небольшим углом. Ничего не вырезано корни слишком близко к спинному мозгу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Изолированных новорожденных спинного мозга обеспечивает послушный метод изучения нервной системы развитию1, 2. В поясничного спинного мозга у новорожденных грызунов, центральный схемы генерации картина может производить фиктивные передвижения в присутствии медиаторов. Это фиктивный передвижения состоит из ритмических увеличение активности, всплески, которые производятся на 0,2 до 0,5 Гц. Эти всплески организованной производить влево-вправо чередования по длине шнура и сгибателей-разгибателей чередование (ипсилатерального относительной L2 до L5). Некоторые генетические мутации у мышей было показано, что аномальное поведение 3-5. Понимание того, как нервной системы спинного мозга изменяется в процессе развития и генетические возмущения будут информировать исследования нервной системы в другом месте в ЦНС.

Следует отметить, что Есть несколько стандартных решений aCSF в регулярном использовании. Ниже приводится таблица наиболее часто используемых подготовки aCSF.

Таблица 1: Общие Композиции aCSF

Лаборатория aCSF Композиция в мМ
Пфафф, О'Донован, Landmesser (3) 128 NaCl, KCl 4, 1,5 CaCl 2, 1 4 MgSO, 0,5 NaH 2 PO 4, 21 NaHCO 3, 30 глюкозы.
Гулдинг, Keihn (5) 111 NaCl, KCl 3,08, 2,52 CaCl 2, 1,25 4 MgSO, 1.18 KH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 11 глюкозы
Brownstone (6) 127 NaCl, KCl 1.9-3.9, 1.2 KH 2 PO 4, 2,4 2 CaCl, MgCl 1,3 2, 26 NaHCO 3, 10 глюкозы
Зискинд-Conhaim Dissection (7) 113 NaCl, KCl 3, 1 CaCl 2, 6 2 MgCl, 25 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4, 11 глюкозы
Зискинд-Conhaim внеклеточной (7) 113 NaCl, KCl 3, 2 CaCl 2, 1 2 MgCl, 25 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4, 11 глюкозы.
О'Донован, нут (8,9) 139 NaCl, KCl 2.9-5, 17 3 NaHCO, 1 2 MgCl, 3 CaCl 2, 12 глюкозы

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Animal Care

Acknowledgements

Сэмюэл Л. Пфафф является профессором в лаборатории экспрессии генов в Солка института биологических исследований и следователь в Медицинского института Говарда Хьюза. Эта работа была поддержана Кристофера и Даны Рив Foundation. Джо Belcovson, Кент Schnoeker и Майк Салливан в мультимедийных ресурсов в Институте Солка оказана помощь с фотографией и редактирования.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KCl P-9333
NaCl S-7653
NaHCO3 S-6297
NaH2PO4 S-9638
Glucose D-9434
CaCl2 C-5080
MgSO4 M-5921
Large Scissors Fine Science Tools 14070-12
Forceps Fine Science Tools 11050-10
Fine Scissors Fine Science Tools 15000-10
Insect pins Fine Science Tools 26002-10
Sylgard 184 (Dow-Corning)
1L volumetric flask
100mL volumetric flask

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Myers, C. P. Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits. Neuron. 46, 37-49 (2005).
  2. Goulding, M., Pfaff, S. L. Development of circuits that generate simple rhythmic behaviors in vertebrates. Curr Opin Neurobiol. 15, (1), 14-20 (2005).
  3. Gallarda, B. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, (2008).
  4. Gosgnach, S. V1 spinal neurons regulate the speed of vertebrate locomotor outputs. Nature. 440, (7081), 215-219 (2006).
  5. Lanuza, G. M., Gosgnach, S., Pierani, A., Jessell, T. M., Goulding, M. Genetic identification of spinal interneurons that coordinate left-right locomotor activity necessary for walking movements. Neuron. 42, (3), 375-386 (2004).
  6. Jiang, Z., Carlin, K. P., Brownstone, R. M. An in vitro functionally mature mouse spinal cord preparation for the study of spinal motor networks. Brain Res. 816, (2), 493-499 (1999).
  7. Ziskind-Conhaim, L., Gao, B. X., Hinckley, C. Ethanol dual modulatory actions on spontaneous postsynaptic currents in spinal motoneurons. J Neurophysiol. 89, (2), 806-813 (2003).
  8. Tabak, J., Rinzel, J., O'Donovan, M. J. The role of activity-dependent network depression in the expression and self-regulation of spontaneous activity in the developing spinal cord. J Neurosci. 21, (22), 8966-8978 (2001).
  9. Chub, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. Chloride-sensitive MEQ fluorescence in chick embryo motoneurons following manipulations of chloride and during spontaneous network activity. J Neurophysiol. 95, (1), 323-330 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics