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脊髓电

Biology

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Summary

一个孤立的新生小鼠脊髓电生理研究的示范。

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Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology. J. Vis. Exp. (35), e1660, doi:10.3791/1660 (2010).

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Abstract

新生小鼠脊髓是一个模型,为研究神经设计电路和运动运动的发展。我们表明脊髓的解剖和准备录音浴人工脑脊液的运动研究中使用的液体。脊髓腹侧神经根的解剖,可以连接到记录电极记录的腰椎脊髓内中央格局产生电路的电生理信号。

Protocol

1。准备人工脑脊液(ACSF)1。首先,我们准备了学联的10倍的股票,没有一个2L的镁或钙。在毫上市的试剂。目录号是指西格玛/爱秩序。

2升10X学联(无镁或钙)
试剂 mM的 g/2L 目录
氯化钾 40 5.96 P - 9333
氯化钠 1280 149.61 S - 7653
碳酸氢钠3 210 35.28 S - 6297
的NaH 2 PO 4 5 1.38 S - 9638
血糖 300 108.12 D - 9434
加蒸馏水至2L

我们还将准备在50ml水硫酸镁和氯化钙2 1M的解决方案,以便在摩尔的调整,从实验到实验,以保证钙的溶液中仍然。

1M钙和镁的股票
试剂 中号 g/50mL 目录
氯化钙 1 7.35 C - 5080
硫酸镁 1 12.33 M - 5921

学联的解决方案必须毒气carbogen(95%O2 / 5%CO2),较低的pH值前添加钙或钙会沉淀。

1升学联
试剂
10X学联 100毫升
1M氯化钙2 1毫升(解剖)2ML(录音)
1M硫酸镁4 1毫升
〜800 mL蒸馏水中,气体与carbogen 2分钟前加入钙添加
加蒸馏水至1L。

前和使用后应冲洗泵和油管和解剖菜。

解剖

在解剖,1mm的钙学联应不断毒气与carbogen。学联可以从一个瓶子被抽走解剖盘和泵瓶从解剖盘或发送到浪费。我们使用的弹性体(Sylgard,道康宁)涂菜进行解剖。

新生小鼠,迅速断头,用锋利的剪刀和剪刀通过腹胸部和腹部切口。动物是那么膛。净膛鼠标与ACSF冲洗。然后固定在动物与昆虫引脚通过前肢和尾巴基地插入解剖盘。

执行腹椎板切除脊柱删除。脊柱举行小镊子和小剪刀的刀片插入立即背脊柱骨。椎板切了一边,然后其他轻轻提起脊柱骨。这是开展了脊柱的长度。

沿着脊髓两侧切割,切断脊神经根和周围的脊髓切开脑膜,脊髓被删除。我们在左,右两侧切,然后我们切开脑膜脊髓背侧自由。隔离线,然后固定到附近的碟学联入口,以保证良好的充氧,如果其他动物解剖。

孤立的脊髓,然后传送到录音盘,用一个小的勺或锅铲。在这里,我们灌注含氧2MM钙学联的准备。脊髓是固定的弹性体涂层的菜和用于移动外,整根吸电极靠近根部的micromanipulators。当电极尖端附近免费的根端,温柔的吸力应用吸引到根吸电极。这个过程可能会重复出现,同时记录几个根源。

图1
图1。断头和剜。快速斩首鼠标用锋利的剪刀。取决于切割的水平,可以实现从脑干或大或小的贡献。 B.将一个刀片,剪刀断头造成胸腔开放。打开腹胸部和腹部的尾巴的基地。取出内脏,冲洗学联。

图2 图2。脊柱:A.去除左剪刀刀片插入脊柱和脊髓的权利,并通过铺设到脊髓腹侧的骨头切脊髓之间的空间。然后将其插入正确的刀片,剪刀,脊柱和脊髓的脊髓和削减左侧之间的空间。 B.重复这一过程,而温柔牵引脊柱。采取以低角度拿着剪刀,小心不要穿刺脊髓。

图3
图3。去除脊髓。左剪刀刀片插入脊髓和削减铺设横向到电源线通过神经根和脊膜脊髓和权利的骨骼之间的空间。然后将其插入正确的剪刀刀片,脊髓和骨头之间的空间铺设横向到电源线通过神经根和脊膜脊髓左侧和削减。 B.最后,轻轻延髓脊髓和背线连接到椎板切开脑膜。同样要注意不要以低角度拿着剪刀穿刺脊髓。不要切断根部太近脊髓。

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Discussion

隔离新生儿脊髓提供了一个研究神经系统development1,2的的易处理的方法。在新生儿啮齿类动物的腰椎脊髓中枢模式产生电路,可以产生神经递质的存在虚构的运动。这个虚构的运动节奏活动增加,阵阵,在0.2至0.5赫兹生产。这些爆发是有组织的生产线和屈,伸交替(同侧L2相到L5)的长度沿左,右交替。在小鼠体内的一些基因突变已被证明有异常行为3-5。了解如何在发展和遗传扰动改变的脊髓神经电路将通知在中枢神经系统的神经回路的研究。

值得注意的是,有几个标准学联在经常使用的解决方案。下面是一个常用的学联筹备工作表。

表1:常见的ACSF成分

实验室 学联组成(毫米)
百福,多诺万,Landmesser(3) 128 4氯化钾,氯化钠,1.5 氯化钙 ,1,21,0.5 硫酸镁的NaH 2 PO 4 3,碳酸氢钠30葡萄糖。
古尔丁,Keihn(5) 111氯化钠,3.08氯化钾,2氯化钙2.52,1.25,1.18 硫酸镁 KH 2 PO 4,25,11葡萄糖碳酸氢钠3
上流社会(6) 1.2 KH 2 PO 4,2.4,1.3氯化钙氯化镁2,26 3,碳酸氢钠10葡萄糖氯化钠,氯化钾1.9-3.9,127
Ziskind Conhaim夹层(7) 1 6 氯化钙 ,氯化镁2,25碳酸氢钠3,1,11葡萄糖的NaH 2 PO 4 3氯化钾,氯化钠,113
Ziskind - Conhaim外(7) 113氯化钠,氯化钾,3,1 2 1 2氯化钙,氯化镁2,3碳酸氢钠25的NaH 2 PO 4,11葡萄糖。
多诺万,鸡(8,9) 139氯化钠,氯化钾2.9-5,17 1 3碳酸氢钠, 氯化钙 ,氯化镁2,3 12葡萄糖

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Disclosures

动物保健

Acknowledgements

塞缪尔百福是在索尔克生物研究所的基因表达实验室教授和霍华德休斯医学研究所研究员。这项工作是由克里斯托弗和Dana里夫基金会的支持。乔Belcovson,肯特Schnoeker和迈克沙利文在索尔克研究所的多媒体资源提供援助,摄影和剪辑。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KCl P-9333
NaCl S-7653
NaHCO3 S-6297
NaH2PO4 S-9638
Glucose D-9434
CaCl2 C-5080
MgSO4 M-5921
Large Scissors Fine Science Tools 14070-12
Forceps Fine Science Tools 11050-10
Fine Scissors Fine Science Tools 15000-10
Insect pins Fine Science Tools 26002-10
Sylgard 184 (Dow-Corning)
1L volumetric flask
100mL volumetric flask

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References

  1. Myers, C. P. Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits. Neuron. 46, 37-49 (2005).
  2. Goulding, M., Pfaff, S. L. Development of circuits that generate simple rhythmic behaviors in vertebrates. Curr Opin Neurobiol. 15, (1), 14-20 (2005).
  3. Gallarda, B. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, (2008).
  4. Gosgnach, S. V1 spinal neurons regulate the speed of vertebrate locomotor outputs. Nature. 440, (7081), 215-219 (2006).
  5. Lanuza, G. M., Gosgnach, S., Pierani, A., Jessell, T. M., Goulding, M. Genetic identification of spinal interneurons that coordinate left-right locomotor activity necessary for walking movements. Neuron. 42, (3), 375-386 (2004).
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