Author Produced

Ryggmärg Elektrofysiologi

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En demonstration av isolering av neonatal musen ryggmärgen för elektrofysiologiska studier.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology. J. Vis. Exp. (35), e1660, doi:10.3791/1660 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den neonatala musen ryggmärgen är en modell för att studera utvecklingen av neurala kretsar och rörelseapparaten rörelse. Vi visar ryggmärgen dissekering och förbereda inspelningen bad konstgjorda cerebrospinalvätska används för rörelseapparaten studier. När dissekerade kan ryggmärgen ventrala nervrötterna knytas till en inspelning elektrod att registrera elektrofysiologiska signaler från den centrala mönstret generera kretsar i ländryggen sladden.

Protocol

1. Förbered konstgjorda cerebrospinalvätska (aCSF) 1. Vi förbereder först en 2L av en 10X lager av aCSF utan magnesium eller kalcium. Reagenser som anges i millimolar. Katalog Siffrorna hänvisar till Sigma / Aldrich.

2 liter 10X aCSF (utan Mg och Ca)
Reagens mM g/2L Katalog
KCl 40 5,96 P-9333
NaCl 1280 149,61 S-7653
NaHCO 3 210 35,28 S-6297
NaH 2 PO 4 5 1,38 S-9638
Glukos 300 108,12 D-9434
Tillsätt destillerat vatten till 2L

Vi kommer också att förbereda 1M lösningar av MgSO 4 och CaCl 2 i 50mL vatten för att möjliggöra justeringar i molaritet från experiment till experiment och att säkerställa kalcium förblir i lösning.

1M Kalcium och Lager Magnesium
Reagens M g/50mL Katalog
CaCl 2 1 7,35 C-5080
MgSO 4 1 12,33 M-5921

Den aCSF lösningen måste gasas med carbogen (95% O2 / 5% CO2) för att sänka pH-värdet innan du lägger kalcium eller kalcium fälls.

1 Liter aCSF
Reagens Volym
10X aCSF 100mL
1M CaCl 2 1 ml (dissekera) 2 ml (inspelning)
1M MgSO 4 1 ml
Tillsätt ~ 800 ml destillerat vatten, gas med carbogen i 2 minuter innan du tillsätter kalcium
Tillsätt destillerat vatten till 1L.

Den pumpar och slangar och dissekera rätter bör sköljas före och efter användning.

Dissection

Medan dissekera bör 1mm kalcium aCSF kontinuerligt gasats med carbogen. Den aCSF kan sugas från en flaska till dissekera skålen och pumpas från dissekera skålen till flaskan eller skickas till avfall. Vi använder en elastomer (Sylgard, Dow Corning) täckta skålen för att utföra dissekering.

Den neonatala musen snabbt halshuggen med skarp sax och ett snitt med en sax genom ventrala thorax och buk. Djuret är då urtagna. Den urtagna musen sköljs med aCSF. Djuret är sedan fästs på dissekera skålen med insekt stift in genom frambenen och vid basen av svansen.

Ryggraden avlägsnas genom att utföra en ventral laminektomi. Ryggraden hålls med liten pincett och ett blad av en liten sax skall införas omedelbart rygg till beniga ryggraden. Lamina skärs på ena sidan och sedan den andra samtidigt som du försiktigt lyfter beniga ryggraden. Detta görs för längden av ryggraden.

Ryggmärgen avlägsnas genom att skära längs båda sidor av ryggmärgen att skilja spinal nervrötterna och skär meningerna kring ryggmärgen. Vi skär till vänster och höger sida, då vi skär meningerna bifogas ryggsidan av ryggmärgen för att frigöra den. De isolerade sladden är sedan fästs på skålen nära aCSF inlopp för att säkra en god syretillförsel om ytterligare djur dissekeras.

De isolerade ryggmärgen överförs sedan till en inspelning maträtt med en liten sked eller spatel. Här har vi BEGJUTA beredningen med syresatt 2mm kalcium aCSF. Ryggmärgen är fästs på elastomer belagda skålen och micromanipulators används för att flytta extracellulära, hela elektroder rot sug nära rötterna. När elektroden tips är nära gratis roten slutet, är skonsam sugkraft gäller att dra roten till sug-elektroden. Denna process kan upprepas för att spela in flera rötter samtidigt.

Figur 1
Figur 1. Halshuggning och urtagning. A. Snabbt halshugga musen med vass sax. Större eller mindre bidrag från hjärnstammen kan uppnås beroende på graden av cut. B. Placera en bladet på saxen i öppningen av brösthålan som skapats av halshuggning. Öppna den ventrala thorax och buk till svansroten. Ta ut inälvorna och skölj med aCSF.

Figur 2 Figur 2. Borttagning av ryggraden. A. Sätt in den vänstra bladet på saxen i utrymmet mellan ryggraden och ryggmärgen till höger i ryggmärgen och skär genom benen om ventrala till sladden. Sätt sedan in den högra bladet på saxen i utrymmet mellan ryggraden och ryggmärgen till vänster i ryggmärgen och skär. B. Upprepa denna process samtidigt som försiktigt dra till ryggraden. Se till att inte punktera ryggmärgen genom att hålla i saxen på en låg vinkel.

Figur 3
Figur 3. Borttagning av ryggmärgen. A. Sätt in den vänstra bladet på saxen i utrymmet mellan ryggmärgen och ben till höger om ryggmärgen och skär genom ryggraden rötter och hjärnhinnorna om lateralt sladden. Sätt sedan in den högra bladet på saxen i utrymmet mellan ryggmärgen och ben till vänster om ryggmärgen och skär genom spinala rötter och hjärnhinnorna om lateralt sladden. B. Slutligen försiktigt lyfta rostralt sladden och skär meningerna ansluter rygg sladden till lameller. Återigen se till att inte punktera ryggmärgen genom att hålla i saxen på en låg vinkel. Klipp inte rötterna för nära ryggmärgen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De isolerade neonatal ryggmärgen ger en lätthanterlig metod för att studera nervsystemet utveckling1, 2. Inom ländryggen ryggmärgen av neonatal gnagare, kan centrala mönster generera kretsar producera fiktiva förflyttning i närvaro av neurotransmittorer. Denna fiktiva rörelseorganen består av rytmiska ökad verksamhet, skurar, som produceras vid 0,2 till 0,5 Hz. Dessa brister är organiserade för att producera vänster-höger växlingen längs sladden och böj-extensor växling (ipsilaterala L2 förhållande till L5). Flera genetiska mutationer på möss har visat sig ha onormalt beteende 3-5. Förstå hur neurala kretsar i ryggmärgen ändras under utveckling och genetiska störningar kommer att informera studier av neurala kretsar någon annanstans i CNS.

Det är anmärkningsvärt att det finns flera standard aCSF lösningar används regelbundet. Nedan finns en tabell över vanliga aCSF preparat.

Tabell 1: Vanliga aCSF Kompositioner

Laboratorium aCSF sammansättning i MM
Pfaff, O'Donovan, Landmesser (3) 128 NaCl, 4 KCl, 1,5 CaCl 2, 1 MgSO 4, 0,5 NaH 2 PO 4, 21 NaHCO 3, 30 glukos.
Goulding, Keihn (5) 111 NaCl, 3,08 KCl, 2,52 2 CaCl, 1,25 MgSO 4, 1,18 KH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 11 glukos
Brownstone (6) 127 NaCl, 1,9-3,9 KCl, 1,2 KH 2 PO 4, 2,4 CaCl 2, 1,3 MgCl 2, 26 NaHCO 3, 10 glukos
Ziskind-Conhaim Dissection (7) 113 NaCl, 3 KCl, 1 CaCl 2, 6 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4, 11 glukos
Ziskind-Conhaim Extracellulär (7) 113 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4, 11 glukos.
O'Donovan, chick (8,9) 139 NaCl, 2,9-5 KCl, 17 NaHCO 3, 1 MgCl 2, 3 CaCl 2, 12 glukos

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Djurvård

Acknowledgements

Samuel L. Pfaff är professor i laboratorier Gene Expression vid The Salk Institute för biologiska studier och en utredare vid Howard Hughes Medical Institute. Detta arbete stöddes av Christopher och Dana Reeve Foundation. Joe Belcovson, Kent Schnoeker och Mike Sullivan i multimedia vid Salk Institute bistått med fotografi och redigering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KCl P-9333
NaCl S-7653
NaHCO3 S-6297
NaH2PO4 S-9638
Glucose D-9434
CaCl2 C-5080
MgSO4 M-5921
Large Scissors Fine Science Tools 14070-12
Forceps Fine Science Tools 11050-10
Fine Scissors Fine Science Tools 15000-10
Insect pins Fine Science Tools 26002-10
Sylgard 184 (Dow-Corning)
1L volumetric flask
100mL volumetric flask

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Myers, C. P. Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits. Neuron. 46, 37-49 (2005).
  2. Goulding, M., Pfaff, S. L. Development of circuits that generate simple rhythmic behaviors in vertebrates. Curr Opin Neurobiol. 15, (1), 14-20 (2005).
  3. Gallarda, B. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, (2008).
  4. Gosgnach, S. V1 spinal neurons regulate the speed of vertebrate locomotor outputs. Nature. 440, (7081), 215-219 (2006).
  5. Lanuza, G. M., Gosgnach, S., Pierani, A., Jessell, T. M., Goulding, M. Genetic identification of spinal interneurons that coordinate left-right locomotor activity necessary for walking movements. Neuron. 42, (3), 375-386 (2004).
  6. Jiang, Z., Carlin, K. P., Brownstone, R. M. An in vitro functionally mature mouse spinal cord preparation for the study of spinal motor networks. Brain Res. 816, (2), 493-499 (1999).
  7. Ziskind-Conhaim, L., Gao, B. X., Hinckley, C. Ethanol dual modulatory actions on spontaneous postsynaptic currents in spinal motoneurons. J Neurophysiol. 89, (2), 806-813 (2003).
  8. Tabak, J., Rinzel, J., O'Donovan, M. J. The role of activity-dependent network depression in the expression and self-regulation of spontaneous activity in the developing spinal cord. J Neurosci. 21, (22), 8966-8978 (2001).
  9. Chub, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. Chloride-sensitive MEQ fluorescence in chick embryo motoneurons following manipulations of chloride and during spontaneous network activity. J Neurophysiol. 95, (1), 323-330 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics