Практический подход к генетического картирования Судьба индуцибельной: Путеводитель по Марку и Трек Клетки В Vivo

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Генетические индуцибельной Судьба картирования (GIFM) знаки и треков клеток с тонкой пространственной и временной контроль

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Brown, A., Brown, S., Ellisor, D., Hagan, N., Normand, E., Zervas, M. A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo. J. Vis. Exp. (34), e1687, doi:10.3791/1687 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Тамоксифен Подготовка и устные зонд процедуры (E8.5)

  • Подготовка 20 мг / мл исходного раствора тамоксифен, растворяя тамоксифен в подогретого кукурузное масло.
  • Инкубируйте раствор при 37 ° С в течение 2 часов на nutator и вихревые периодически.
  • Защита тамоксифен фондовом от света месте, хранить при 4 ° С, и использовать на срок до одного месяца.
  • Для экспериментов судьба отображение, создание племенных пар, состоящих из швейцарских Вебстер женщины (дикого типа, приобретенных у Taconic) и мужчин и проведение конкретных генов Крир аллеля Т и репортер аллеля. Для демонстрационных целей, мы используем Wnt1-Крир Т; mGFP мужчин (Ellisor 2009).
  • Проверьте швейцарские женщины Вебстер каждое утро в течение появление вагинальной пробки. Назначить утро (0900) в день вагинальных плагин считается 0,5 дней после полового акта и вычислить дату администрации тамоксифена на основе этой отправной точки. (Для этого эксперимента, эмбриональные день было использовано 8,5).
  • Используйте 1 мл шприц с иглой для кормления животных (20G х 1-1/2) составить 200 мкл раствора тамоксифен акции (4 мг тамоксифена).
  • Твердо сдерживать времени беременных женщин швейцарских Вебстер, держа задней части шеи и спины, чтобы обездвижить голову и перевернуть так брюшную сторону вверх.
  • Держите хвост между свободными пальцы, чтобы держать тело в прямую линию.
  • Место кормления иглу в углу рта и нежно руководство иглы по небу.
  • Вращайте иглу так, чтобы она параллельно телу, одновременно наклоняя голову назад, чтобы держать шею прямо.
  • Руководство иглу вниз по пищеводу, в сторону желудка. Будьте осторожны, чтобы не ввести в трахею. Если есть сопротивление на иглу, кляп животного занимается рефлекс, или, если мышь борьбы, немедленно удалить иглу и попробуйте зонд снова.
  • После кормления игла находится в желудке, администрирования тамоксифен в желудок и возвращения женщины к ее дому клетке до даты вскрытия.

Краниотомия:

  • Intracardially заливать взрослых судьба отображается мышь с 4% PFA и удалить голову с ножницами, сокращая через позвоночник чуть выше плеч.
  • Выполнить скальпелем вдоль спинной средней линии головы (ростральной к хвосту), чтобы прорваться через кожу головы и подвергать черепа.
  • Использование скальпеля, соскрести лишнюю ткань или мышцы вдоль боковой и задней черепной коробки.
  • С щипцы, прокол черепа в средней линии просто ростральнее обонятельных луковиц и создать небольшое отверстие для размещения кончиками тонких ножниц.
  • Вставьте тонкий ножницы в это отверстие и сделать разрез медиальнее боковые приблизительно на длину обонятельных луковиц. Этот отрезок сломается черепа на пересечении носовой кости и лобной кости и обеспечивают хороший доступ для ножницами.
  • Разрезать вдоль сагиттального швов в черепе (спинной средней линии) и обязательно держать ножницы советы угловые от мозга во избежание повреждения основной ткани.
  • Аккуратно понять черепа пинцетом и удаляйте кости вдоль медиальной разрез подвергать мозга. Череп может чип с небольшими кусочками или оторваться в больших разделах. Продолжайте использовать пинцет, чтобы удалить все лобной, теменной, межтеменной, и затылочной костей.
  • Трещина кости упаковывая paraflocculi (расположенного вдоль боковых краев мозга на уровне мозжечка), зажимая сферической кости с каждой стороны. Осторожно потяните от костей.
  • Включите голову вверх дном (спинной стороной вниз) и использовать щипцы разорвать черепных нервов и освободить мозг от черепа.

Всего микроскопии горе: Взрослый мозг

  • Оценка взрослого мозга для GFP маркировки использованием флуоресцентных рассекает области.
  • Передача мозга чашке Петри содержащие PBS и сфотографировать использованием PictureFrame или другого соответствующего программного обеспечения.

Всего микроскопии горе: E12.5 Эмбрионы

  • Оценка целых зародышей крепление для GFP маркировки использованием флуоресцентных рассекает области.
  • Передача те, которые являются положительными GFP целыми крепления к чашке Петри содержащие PBS и сфотографировать использованием PictureFrame или другого соответствующего программного обеспечения.
  • Используйте пинцет, чтобы отщипывать кусочек хвоста от каждого эмбриона, поместить каждую часть в ПЦР-пробирку и генотип ткани с помощью ПЦР (Ellisor 2009) для обоих аллелей, чтобы подтвердить результаты, полученные через весь анализ монтирования.

Микро-вскрытие и подготовка эксплантатов брюшной средний мозг от E12.5 эмбрионов

  • После вскрытия из матки цепи и идентификаторentification судьбы отображаемой эмбрионов целыми монтажа флуоресценции, трансфер эмбрионов ледяной стерильной PBS в блюдо культуре клеток.
  • Использование тонких ножниц, удалить голову части эмбриона резка в поперечном направлении, каудально rhombomere 1.
  • Затем удалите ростральной части головы короны прорезать промежуточного мозга. Это выставит ламповую структуру, в которой 4-го желудочка через мезенцефальных форму пузырька связующим звеном между спинной и брюшной ткани.
  • Осторожно вставьте ножницеобразный наконечниками в 4-й желудочек, и надрез вдоль спинной средней линии, каудально ростральной, полностью открыть трубу, создание "открытой книги" подготовки. Вентрального среднего мозга теперь она подвергнется медиально, а два спинных половин мозга будет находиться сбоку.
  • Удалите все оставшиеся без нервной ткани под вентрального среднего мозга для того, чтобы ткань лежала более решительно. В случае необходимости, сделать вырезы в ростральной и хвостовой аспекты, такие, что спинной «крыльях» эксплантов будет лежать, а также. Эксплантов должна выглядеть "бабочка, в котором спинной мозга представляет крылья, и rhombomere один хвост.
  • Для еще большей изоляции вентрального среднего мозга для анализа FACS или экспериментов культуре клеток, удалите боковые (спинной стороны) ткани.

Представитель Результаты:

В этом GIFM эксперимент, Wnt1-экспрессирующие клетки постоянно и heritably отмеченные во время эмбриогенеза путем введения тамоксифена на E8.5 к Wnt1-CreERT; mGFP эмбрионов. Впоследствии эти клетки помечены визуализируются с помощью целого флуоресценции смонтировать и раздел иммуногистохимии чтобы определить, как Wnt1 клеток, полученных способствовать нервных структур по развитию. Всего горе флуоресценции зависит от мембраносвязанных GFP компонент репортер mGFP и, следовательно, обеспечивает сотовой информации, а также всеобъемлющие зрения Wnt1 полученных нейронных проекций. Например, с тамоксифеном управления на E8.5, Wnt1-CreERTmGFP эмбрионов на E12.5 выставку GFP флуоресценции в основном в средний мозг, задний задний мозг и спинной мозг (рис. 1А). При большом увеличении, тонкой нейронов прогнозы видел иннервирующих мозга, стенки тела, конечностей, а также черепно-лицевой области. На этой стадии развития эмбрион является прозрачным и внутренней маркировки GFP легко различить. Однако, как мозг развивается, плотность зрелые ткани скрывает GFP флуоресценции, исходящие из внутренних структур мозга. Таким образом, с тамоксифеном управления на E8.5, лишь незначительные маркировки GFP наблюдается в превосходной холмов среди взрослого целыми горе флуоресценции (рис. 1С, вставка). Кроме того, некоторые аксонального прогнозы видел бегущую вдоль брюшной поверхности заднего мозга (не показаны). Напротив, когда тамоксифен назначали в E9.5 значительные маркировки GFP происходит во всем уступает холмов (рис. 1В, вставка). Это увеличение в целом флуоресценции крепление может означать, что Wnt1-клеток, экспрессирующих на E9.5 способствовать более существенный вклад поверхностных областях спинного мозга или расширить несколько процессов в этом регионе, чем Wnt1 клеток, экспрессирующих от E8.5. В любом случае, эта разница в целом горе флуоресценции отражает динамическую природу Wnt1 выражения во время разработки и демонстрирует, как GIFM могут быть использованы следовать разные популяции клеток из эмбриона в зрелые взрослые.

С иммуногистохимии, судьба отображаются разделы ткани Wnt1-CreERT; mGFP животных анализируются на клеточном уровне. Антитела против GFP и β-галактозидазы (β-Gal) используются в сочетании с разнообразием тканей специфических биомаркеров для определения мелкого масштаба сотовой вклад Wnt1 происхождение от нервных структур и клеточных типов. С тамоксифена управления на E8.5 и тканей анализа на E12.5 дважды положительных клеток (GFP + и β-гал +) наблюдаются по всему среднего и заднего мозга с проекциями пробегает по вентрального среднего мозга (рис. 1В). Во взрослом мозге, Wnt1-линии отмечены на E8.5 порождает многие структуры мозга, включая высших и низших холмов, а также в непосредственной близости от дофаминергических клеточных популяций вентральной области покрышки и черной субстанции (рис. 1D) (см. Также Зервас 2004). В противоположность этому, Wnt1-линии отмечены на E9.5 порождает уступает холмов, а также нейроны в непосредственной близости от дофаминергических клеточных популяций (рис. 1F).

Рисунок 1
Рисунок 1 представитель Результаты Wnt1-рок отображения.:

Примеры целом монтажа и иммуноцитохимии приводит Wnt1-CreERT; mGFP эмбрионов и взрослых судьба мозги отображается (помечены) в E8.5 (AD)и E9.5 (EF). А. Wnt 1-Крир; mGFP эмбрионов на E12.5 выставку GFP флуоресценции в первую очередь в среднем мозге (Мб), задний задний мозг (Hb) и спинного мозга (Sp). Б. Помечено в клетках визуализироваться и анализироваться на клеточном уровне, иммуногистохимии, как показано на этом 1-мкм оптической части (40x цели, г-серии приобретения). Ядерный β-галактозидазы (nβ-гал) антител маркировку (красный) и GFP антител маркировки (зеленый) показывает судьба отображаемой клетки показано на вентральной мозга. Здесь рекомбинированное клетки двойной положительный (nβ-гал + / GFP +) из-за характера условного репортер mGFP. C. Всего монтажа расцвета микроскопия выявляет слабые флуоресценции GFP в превосходной холмов (SC) для взрослых (вставка). Оценка Wnt1 линии отмечены на E8.5 на взрослых участки с низким увеличением (5X) микроскопия показывает, что Wnt1 линии порождает мозга структур, включая улучшенный (SC) и нижней (IC) холмов (С). Д. 40x, 1 мм оптической части взяты из вентрального среднего мозга в непосредственной близости от дофаминергических нейронов с nβ-гал + клеток и богатой GFP + аксонального сплетения. Е. Маркировка на результаты E9.5 к существенному маркировки GFP, который легко наблюдается в нижних бугорок среднего мозга целыми горе флуоресценции (вставка). Wnt1 линии отмечены на E9.5 на взрослых секций (β-гал +, красный) сосредоточена в нижних бугорок (спинно-заднем среднего мозга), как видно с низким увеличением (5X) микроскопии (Е). Ф. 40x, 1 мм оптической части взяты из вентрального среднего мозга в непосредственной близости от дофаминергических нейронов с nβ-гал + клеток и богатой GFP + аксонального сплетения. Wnt1 полученных нейронов отмечается при сравнении E8.5 E9.5 постепенно запрещено способствует спинного мозга, в то время Wnt1 линии сохраняется в содействии вентрального среднего мозга.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

GIFM система, которую мы продемонстрировали, могут быть использованы для ответа широкий круг вопросов в различных клеточных процессов. Например, мыши разработана с различными драйверами Cre может быть использована для целевых любого типа клеток, тканей или генетической линии интересов. Кроме того, поскольку тамоксифен могут быть введены в любой эмбриональный или послеродового момент времени, рекомбинации могут быть направлены на любой соответствующей стадии развития. Пространственным и временным контролем этой системы идеально подходят для исследования клеток, экспрессирующих как конкретные гены способствуют структуры или область интереса, а также миграции клеток и структурирование событий в процессе разработки.

Помимо того, что маркировка и визуализации клеток иммуногистохимии (рис. 1), GIFM методология может быть использована для различных приложений. Объединив GIFM с условным нокаут аллель, генетические потерей функции может быть во времени и пространстве, ориентированные на соответствующие клеточные популяции, которые являются одновременно отмечены репортер аллеля. Кроме того, ткань собранные от судьбы отображается животные могут быть использованы в сочетании с флуоресцентной-активированный сортировки клеток (FACS), чтобы физически изолировать клеток, экспрессирующих гены репортера или отдельных маркеров в различных популяциях. Помечено в тканях изолированы во время эмбриогенеза или из взрослых животных может быть культурным, позволяя доставки лекарств или генетические конструкции для линий определены в лабораторных условиях.

Наша лаборатория использует результаты, полученные из GIFM исследования, чтобы помочь ответить на сложные вопросы, связанные с неврологическими заболеваниями, такими как болезнь Паркинсона, шизофрения, аутизм и клубневые склероз. Понимая, какие группы населения клеток пострадавших в каждом из этих заболеваний, и как эти группы населения меняться с течением времени на мышах, мы надеемся, чтобы лучше понять патологии наблюдается и даже привести к возможным средством лечения в клинических условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Все авторы способствовали в равной степени к этой работе и перечислены в алфавитном порядке. Вклад каждого отдельного очевидно, его или ее участие в видео-статьи.

Acknowledgments

Мы благодарны С. Арбер для mGFP мышей и членам лаборатории Зервас, кто критически прочитать документ и оказала техническую помощь. А. Браун был поддержан наук о мозге Каплан летних исследований Высшей премии. Е. Normand была поддержана Программой наук о мозге премии исследований Высшей. Это исследование было также финансируются запуске научно-исследовательские фонды (МЗ).

References

  1. Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system. Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).
  2. Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1. Neuron. 43, 345-357 (2004).

Comments

2 Comments

  1. it is quite awesome how cell lineage could be traced upon using the technique of fate mapping..

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 25, 2012 - 10:34 PM
  2. it is quite awesome how cell lineage could be traced upon using the technique of fate mapping..

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 25, 2012 - 10:34 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics