一个实用的方法遗传诱导的命运映射:一个视觉引导标记和跟踪细胞在体内

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Biology

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Summary

遗传诱导的命运映射(GIFM)标记和细胞与精致的空间和时间的控制轨道

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Brown, A., Brown, S., Ellisor, D., Hagan, N., Normand, E., Zervas, M. A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo. J. Vis. Exp. (34), e1687, doi:10.3791/1687 (2009).

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Abstract

命运的地图生成标记和跟踪体内细胞,以确定如何祖贡献的具体结构和细胞类型,在发展中国家和成人组织。在这个概念的发展 G eneticnducible F 吃中号apping(GIFM),将基因表达,细胞的命运,并在体内的细胞行为,创建基于遗传谱系的命运地图。

GIFM战功的的X CreER线,X是一个基因或基因调控元件的设置,赋予一个修改后的噬菌体蛋白质,Cre 重组酶(CreER T) 表达空间 。CreER T包含一个修改的E strogen ř eceptor配结合域呈现CreER T扣押在细胞质中的药物他莫昔芬的情况下。他莫昔芬发行CreER T,即转移到细胞核与调解由loxP位点两侧的DNA序列之间的重组结合。在GIFM,重组之间,通常会出现一个loxP位两侧停止前,如GFP报告基因的卡带。

小鼠繁殖包含一个区域或特定细胞类型 CreER和有条件的记者等位基因。未经处理的小鼠不会有标记,因为在记者停止卡带防止进一步的报告基因的转录。我们管理灌胃定时怀孕的女性,这提供CreER T版本和随后易位到细胞核去除记者从停止磁带的时间控制的他莫昔芬。重组之后,记者等位基因的组成和heritably表达。这一系列事件标志着细胞等,他们的遗传史是不可磨灭的记录。重组记者,作为一个高保真的遗传谱系追踪器,一旦上,从最初用来驱动CreER T基因表达耦合。

我们申请GIFM在小鼠成年细胞类型和组织的遗传谱系研究的正常发展和确定贡献。我们也使用GIFM遵循细胞突变的遗传背景,以更好地了解复杂的表型,模仿人类遗传性疾病的显着特点。

此视频文章指南,通过实验方法的研究人员成功申请GIFM。我们证明的方法,使用特点Wnt1 CreER T;由 mGFP小鼠胚胎一天(五)8.5管理通过清扫在E12.5和epifluorescence立体显微镜分析灌胃他莫昔芬。我们还演示了如何微为外植体的制备或流式细胞仪分析解剖的命运映射域和成人命运映射的大脑解剖整装荧光成像。总的来说,这些程序允许研究人员在发育生物学和疾病模型解决的关键问题。

Protocol

他莫昔芬的制备及灌胃程序(E8.5)

  • 通过溶解在他莫昔芬预热玉米油,准备了他莫昔芬20毫克/毫升的原液。
  • 解决方案在37℃,2小时一个nutator和涡间歇。
  • 他莫昔芬的股票免受光,储存在4 ° C,并使用长达1个月。
  • 命运映射实验,建立一个养殖对瑞士韦伯斯特女性(野生型;从Taconic公司购买)组成的和男性携带一个基因的特定CreER T等位基因和记者等位基因。出于演示的目的,我们使用Wnt1 - CreER ; mGFP男性(Ellisor 2009年)。
  • 每天早晨检查瑞士韦伯斯特女性阴道塞的外观。候为0.5天,性交后阴道塞的一天上午(0900)和日期计算他莫昔芬管理基于这个出发点。 (在这个实验中,使用胚胎每天8.5)。
  • 使用动物饲养针(20克x 1-1/2)1毫升注射器制订的他莫昔芬原液(4毫克他莫昔芬)200μL。
  • 坚决抑制抓颈背的时候怀孕的瑞士韦伯斯特女性和固定头部和翻身所以腹侧的一面朝上。
  • 保持自由手指之间的尾巴保持身体在一条直线上。
  • 放置到嘴角的喂养针,轻轻地引导屋顶沿口针。
  • 旋转针头,这是对身体平行,而同时倾斜的头部,背部保持颈部挺直。
  • 指南上下针,食管向胃。要小心,不要进入气管。如果有阻力针,动物的咽反射从事,或如果鼠标斗争,立即取出针,并再次尝试灌胃。
  • 一旦喂养针在肚子里,管理进肚子里的他莫昔芬和解剖之日起,直到返回到她家笼女。

开颅手术:

  • Intracardially灌注成人的命运映射与4%的煤灰鼠标,并用剪刀除去头只以上的肩膀脊柱切割。
  • 沿背中线头(喙尾鳍)穿过头皮和揭露的scull的运行手术刀。
  • 使用手术刀,刮走沿着头骨侧面和后部的任何多余的组织或肌肉。
  • 镊子,穿刺只是延髓的嗅球,并创建了一个小洞,以容纳细剪刀提示中线的头骨。
  • 插入此孔的罚款剪刀和一个切口内侧向外侧约嗅球长度。这一削减将打破在鼻骨和额骨的交集的头骨,并提供良好的剪刀的访问。
  • 沿矢状一定要保持远离大脑的角度,以避免损坏的根本组织剪刀提示(背中线)在颅骨缝线切割。
  • 轻轻抓住沿内侧切口颅骨剥离钳和骨暴露大脑。头骨可能芯片小块或打破在较大的部分。继续使用镊子,以消除所有的额叶,顶叶,interparietal,和枕骨骨。
  • 破解套paraflocculi(沿水平小脑位于大脑外侧边缘),每边捏的球状骨的骨头。轻轻地拉开了距离的骨头。
  • 转动头部倒挂(背面朝下),并使用镊子断绝颅神经和大脑释放的头骨。

全山显微镜:成人的大脑

  • 评估成人大脑的GFP标记用荧光解剖范围。
  • 脑转移到培养皿中含有PBS和照片使用PictureFrame或其他适当的软件。

整个山显微镜:E12.5胚胎

  • 评估的GFP标记的整装胚胎,用荧光解剖范围。
  • 转让那些GFP整个安装到培养皿中含有PBS和照片使用PictureFrame或其他适当的软件积极。
  • 使用镊子夹断的尾巴从每个胚胎中的一小片,放置在每一个PCR管片和基因型的组织使用两个等位基因PCR(Ellisor 2009),以确认通过整装分析中看到的结果。

显微解剖和E12.5胚胎腹侧中脑外植体的制备

  • 继剥离子宫链和ID整个安装荧光,转让冰冷的无菌PBS在细胞培养皿中的胚胎的命运映射胚胎entification。
  • 用细剪刀,取出的胚胎切割横头部分,尾椎菱1。
  • 接下来,删除,透过间脑冠状切开​​的喙头部分。这将会使一个筒状结构,其中第四脑室通过脑神经囊泡形成一个背,腹组织之间的渠道。
  • 小心地插入剪刀的提示,进入第四脑室,并剪断,沿背中线,尾椎到延髓,全面开放管,创造一个“开卷”的准备。现在暴露腹侧中脑内侧,而将驻留的中脑背侧的两个半横向。
  • 下面的腹侧中脑组织打下更断然删除任何剩余的非神经组织。如果需要,请在延髓和尾鳍等方面以及背的“翅膀”的外植体平放的凹槽。外植体,现在应该像“蝴蝶,其中背侧中脑代表的翅膀,和菱1尾部。
  • 为了进一步孤立的流式细胞仪分析细胞培养实验的腹侧中脑,删除的横向组织(背方面)。

代表性的成果:

在这个GIFM实验中,Wnt1表达细胞是永久和heritably标记胚胎发育过程中,他莫昔芬在E8.5管理Wnt1 - CreERT; mGFP胚胎。随后,这些标记的细胞,是通过整装的荧光和部分免疫组化 ,以确定如何Wnt1衍生细胞对神经结构的跨越发展可视化。整装荧光依赖于膜结合GFP的mGFP记者组成部分,因此,提供细胞的信息以及Wnt1源性神经预测的总体看法。例如,与他莫昔芬在E8.5,Wnt1 CreERTmGFP在E12.5展览,主要的中脑,后后脑和脊髓(图1A)绿色荧光的胚胎管理。在高放大倍率,精细的神经元预测支配的脑,体壁,四肢和颅面地区。在这一发展阶段,胚胎是半透明的,内部的GFP标签是很容易看出端倪。然而,由于大脑的发育,成熟的组织密度掩盖内部的大脑结构所产生的绿色荧光。因此,与他莫昔芬在E8.5管理,只有轻微的绿色荧光蛋白标签是在优越的整装荧光(图1C,插图)成人丘观察。此外,一些神经轴突的预测是沿后脑腹面窃喜(未显示)。相反,当他莫昔芬是在E9.5管理,出现大量的绿色荧光蛋白标签整个伪劣丘(图1B,插图)。在整个装载荧光的增加可能表明 Wnt1表达细胞在E9.5作出更大的贡献明显背脑浅表地区或延长这个区域内,而不是从E8.5细胞Wnt1表达更多的进程。无论如何,这在整个装载荧光Wnt1表达的差异,反映在开发过程中的动态性质,并演示了如何GIFM可以被用来追踪从胚胎到成年不同的细胞群。

随着免疫组织化学,从Wnt1 CreERT的命运映射的组织切片 ; mGFP动物在细胞水平上进行了分析。 GFP和β-半乳糖苷酶(β-半乳糖苷酶)抗体结合各种组织特异性的生物标志物来确定罚款规模Wnt1谱系的细胞神经系统结构和细胞类型的贡献。他莫昔芬管理E8.5和E12.5组织分析,双阳性细胞(绿色荧光蛋白和β-半乳糖苷酶)是观察整个窃喜预测通过腹侧中脑(图1B)中脑和后脑。 Wnt1宗族标记在E8.5在成人大脑,产生了许多脑结构的优势和劣势丘,以及在附近的腹侧被盖区和黑质(图1D)的多巴胺能神经细胞群(见也Zervas 2004年)。相比之下,在E9.5标记的Wnt1系引起下丘,以及在多巴胺的细胞群(图1F)附近的神经元。

图1
图1 Wnt1的命运映射代表性的结果

整个安装和免疫细胞化学结果Wnt1 - CreERT例子; mGFP胚胎和成人大脑的命运E8.5(AD)的映射(标记)E9.5(EF)。答:Wnt信号1 CreER; mGFP胚胎E12.5 GFP荧光的展览,主要在中脑(MB),后后脑(HB)和脊髓(SP )。 B.标记的细胞,可视化和分析免疫组织化学在细胞水平上,在这1微米厚的光学部分(40X目标,Z系列收购)所示。核β-半乳糖苷酶(nβ- GAL)抗体标记(红色)和GFP抗体标记(绿色)表示命运映射显示在腹脑细胞。在这里,重组细胞双阳性(nβ-半乳糖苷酶+ / GFP +)因为条件 mGFP记者的性质。 C.全装载荧光显微镜,揭示了成人优越丘(SC)(插图)淡淡的绿色荧光。评估Wnt1血统上标注的成人节E8.5低倍率(5倍)显微镜表明,Wnt1血统引起脑的结构,包括上级(SC)和劣势(IC)丘(C ) D.一个40X,1毫米的光学部分在腹侧中脑多巴胺能神经元nβ-半乳糖苷酶+细胞和丰富的GFP +轴突丛附近。 E.整装荧光(插图)的脑下丘,很容易观察到的大量的绿色荧光蛋白标签E9.5结果标记。 Wnt1血统上标注的成人节(β-半乳糖苷酶+,红)在E9.5集中在低倍率(5倍)显微镜(五)下丘(背后路脑)。 F.一个40X,1毫米的光学部分在腹侧中脑多巴胺能神经元nβ-半乳糖苷酶+细胞和丰富的GFP + 轴突丛附近。 E8.5与E9.5标记Wnt1源性神经元正逐步从背脑限制,而Wnt1血统坚持促进腹脑。

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Discussion

GIFM系统,我们已经证明可以用于广泛的多种细胞过程中的问题的答案。例如,具有不同的Cre司机工程小鼠可以用来针对任何类型的细胞,组织或利益的遗传谱系。此外,因为他莫昔芬可在任何时间点胚胎或产后管理,重组,可以针对任何相关的发展阶段。该系统的空间和时间的控制是研究如何表达特定基因的细胞结构或地区的利益,以及细胞迁移和图案在开发过程中的事件作出贡献的理想。

除了简单的标记和可视化细胞免疫组化(图1),GIFM方法可用于多种应用。相结合,有条件的基因敲除等位基因GIFM,基因的功能丧失可以被时间和空间上有针对性地相关的细胞群,同时与记者等位基因标记。另外,从映射动物的命运收集的组织,可用于荧光激活细胞分选(FACS)进行物理隔离到不同的人群表达报告基因或特定标记的细胞结合。可以培养的胚胎发育过程中或从成年动物中分离的标记组织,允许运送药物或遗传结构在体外定义的谱系。

我们的实验室使用GIFM研究取得的结果,以帮助回答神经系统疾病,如帕金森氏症,精神分裂症,孤独症和结节性硬化症,所带来的复杂问题。通过了解细胞的人口在这些疾病,以及如何改变这些人群在小鼠模型的时间的影响,我们希望更好地了解病理观察,甚至可能意味着对治疗在临床上设置。

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Disclosures

所有作者同样这项工作作出了贡献,按字母顺序列出。每一个人的贡献是明显的他或她参加在视频文章。

Acknowledgments

S. mGFP小鼠阿伯尔和批判地阅读文件,并提供技术援助的Zervas实验室的成员,我们非常感谢。答:布朗支持大脑科学卡普兰夏季研究生研究奖。 E.诺曼德是支持的脑科学计划的研究生研究奖。这项研究是由启动研究经费(MZ)。

References

  1. Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system. Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).
  2. Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1. Neuron. 43, 345-357 (2004).

Comments

2 Comments

  1. it is quite awesome how cell lineage could be traced upon using the technique of fate mapping..

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 25, 2012 - 10:34 PM
  2. it is quite awesome how cell lineage could be traced upon using the technique of fate mapping..

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 25, 2012 - 10:34 PM

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