PuraMatrix Инкапсуляция раковых клеток

Biology
 

Summary

Это видео демонстрирует, как для инкапсуляции и культуры клеток рака в PuraMatrix, имеющихся в продаже самостоятельно сборки пептидной геля.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Abu-Yousif, A. O., Rizvi, I., Evans, C. L., Celli, J. P., Hasan, T. PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells. J. Vis. Exp. (34), e1692, doi:10.3791/1692 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Увеличение данные свидетельствуют о том, что клетки рака культивирования в трех измерениях более точно повторяет сложности биологии опухоли. Многие из этих моделей используются восстановленные базальной мембраны, полученных от животных, которые содержат различное количество факторов роста и цитокинов, которые могут влиять на рост этих моделях клеточных культур. Здесь мы подробно описывать подготовку и использование PuraMatrix, имеющихся в продаже самостоятельно сборки пептидной гель, который лишен животного происхождения материала и патогенные для инкапсуляции и распространяются клетка рака яичников линии, OVCAR-5. Мы начнем с описания того, как подготовить PuraMatrix перед использованием. Далее, мы показали, как правильно смешивать PuraMatrix и клеточной суспензии для инкапсуляции клеток в гидрогеля. После добавления культуры клеток или инъекции в физиологической среде, пептидные компоненты PuraMatrix быстро самостоятельно собирает в 3D-гидрогель, который показывает волокнистые структуры нанометрового масштаба с средним размером пор 5-200 нм

Protocol

Технические примечания:

  • Гелеобразование инициируется добавлением соли. Поэтому, очень важно, что ни соли вступают в контакт с PuraMatrix до гелеобразования желательно; воздействия соли очень низкой ионной силы (например, <0,05 М) приведет к необратимым гелеобразования.
  • Оставшийся запас решений, которые готовы могут быть использованы позднее, если они не вступают в контакт с солями. Вам не нужно беспокоиться о том повторить ультразвуком.
  • Пузырьки воздуха могут быть удалены aliquoting PuraMatrix в стерильные пробирки с последующим центрифугированием.
  • Будьте очень осторожны при изменении СМИ как стремление может легко нарушить PuraMatrix постели.

Материалы по теме:

BD PuraMatrix RAD16 пептида Гидрогель-1% (Cat # 354250): общая концентрация пептида неразбавленной смеси составляет 10 мг / мл.

  • Вода Sonicator Ванная или Vortex
  • 96-луночного блюдо культуре клеток
  • Медиа культуре клеток
  • Стерильные Фильтрованный H 2 O
  • Стерильные Фильтрованный 20% сахарозы
  • Cells (всего на 5000 клеток / лунку): OVCAR-5

Все шаги должны быть выполнены в асептических условиях.

Порядок действий:

  1. Разрушать ультразвуком 1% PuraMatrix (RAD16) в sonicator водяной бане в течение 30 минут, чтобы уменьшить вязкость перед использованием.
  2. 1% PuraMatrix решения теперь могут быть аликвоты в стерильные пробирки для упрощения будущих экспериментов.
    1. Избегайте образования пузырьков воздуха, а если они образуют просто спином вниз стерильные пробирки, содержащие PuraMatrix при 1000 оборотов в минуту (300 мкг) в течение 5 минут.
    2. Общей концентрации пептида неразбавленном смеси составляет 10 мг / мл.
  3. Два подхода по 4 скважины будут покрыты в дозе 2,5 мг / мл и 1,25 мг / мл общей концентрации пептида, соответственно.
  4. Развести PuraMatrix в каждой лунке комплекте с 0,2 мкм стерильно фильтруют 20% сахарозы и 13,3% сахарозы к общей пептидной концентрации 5 мг / мл и 2,5 мг / мл, соответственно, для достижения 2x концентрация BD PuraMatrix в 10% сахарозы.
    1. Сделать 20% сахарозы, развести 10 г сахарозы, то объем до 50 мл воды.
    2. 13% и 10% сахарозы может быть получен путем разбавления 20% маточного раствора.
      1. 13% сахарозы (на каждые 10 мл): 6,5 мл 20% сахарозы + 3,5 мл стерильного H 2 O.
      2. 10% сахарозы (на каждые 10 мл): 5,0 мл 20% сахарозы + 5,0 мл стерильного H 2 O.
  5. Подготовка мастер смесь пептидных PuraMatrix в зависимости от количества скважин вы собираетесь пластины. (См. пример ниже). Затем аликвоту в отдельные пробирки с 25 мл мастера микса.
    1. Мастер смесь должна быть готова в два раза желаемой конечной концентрации общего пептида, как это будет разбавляют равным объемом клеток в процессе металлизации.
      Рисунок 1
  6. Подготовка клеточные суспензии по trypsinizing культурах клеток монослоя клеток.
    1. 2 мл 0,05% трипсина ЭДТА может быть использована для каждого Т-75 Flask.
  7. Нейтрализовать трипсина путем добавления культуры клеток, содержащих 10% тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (использовать не менее 2 мл среды на мл трипсина использовали на предыдущем шаге.)
  8. Центрифуга клетки при 1000 оборотов в минуту (~ 300 мкг) в течение 5 минут, чтобы создать клеточный осадок.
    1. Ресуспендируют клеток в 10% стерильно фильтруют сахарозы.
    2. Граф клеток и со спином вниз снова при 1000 оборотов в минуту (~ 300 мкг) в течение 5 мин для удаления следовых количеств соли содержится в средствах массовой информации.
  9. Ресуспендируют OVCAR-5 клеток в 10% сахарозы, 2,0 х 10 5 клеток / мл, так что окончательное число клеток на лунку будет 5000 клеток в каждую лунку.

    Следующие шаги должны быть выполнены быстро.
  10. Добавьте 25 мкл 2,0 х 10 5 клеток / мл суспензии для первого индивидуального пробирку 25 мкл мастер смесь PuraMatrix, как показано на схеме.
    1. Быстро перемешать с помощью пипетки (~ 5 раз вверх и вниз) в трубке без введения пузырьков воздуха.
    2. Потом пипеткой 50 мкл суспензии клеток / PuraMatrix смесь в соответствующую лунку 96 и блюда.
    3. Инициировать гелеобразования PuraMatrix BD, осторожно пипетки 150 мкл культуры клеток (RPMI + 10% FBS) в сторону хорошо
      Рисунок 2
  11. Повторите действия, описанные в 8, пока все скважины были покрыты.
  12. Через 30 минут очень осторожно удалить ~ 2 / 3 от носителя с помощью 200 мкл пипетки, чтобы уравновесить рН гидрогеля.
    1. НЕ ИСПОЛЬЗУЙТЕ Вакуумный аспиратор, так как это нарушает MATRIX
    2. Место пипетки в хорошо так, чтобыон не касается PuraMatrix кровать и осторожно извлекайте носитель из колодца.
    3. Следует проявлять осторожность, чтобы не нарушить матрицы при культуре клеток в PuraMatrix.
  13. Очень осторожно добавить 150 мкл свежей среды культуры клеток в сторону так, содержащих клетки инкапсулированных в PuraMatrix.
  14. Изменение культуры клеток в каждой лунке каждые 48 часа со свежей культуральной среды, тщательно повторяя шаги 10 и 11.

Представитель Результаты:

Рисунок 1
Рисунок 1. OVCAR-5 инкапсулированные клетки, как описано в предыдущем протоколе. Изображения были получены с помощью перевернутого Olympus FV1000 микроскоп с Spectra-Physics DeepSee Ti: Sapphire лазера, настроенного на 750 нм. Изображений сессий были проведены в дни 1, 3, 5 и 7 после металлизации. Большое рабочее расстояние, вода погружения 40x цель (Olympus LUMPLFLN 0,8 NA) был использован для изображения через PuraMatrix. Трехмерная объемы были собраны за счет приобретения изображение стеки в 1,47 мкм осевого шага. Два не-descanned детекторов собраны аутофлюоресценция выбросов использованием фиолетового (440-490 нм) и зеленого (510-550 нм) полосового фильтра. Окончательного изображения и глубину стека фильмы были обработаны с использованием ImageJ путем сочетания обоих каналов обнаружения. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 1.

References

  1. Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. Designer self-assembling Peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures. PLoS One. 1, e119-e119 (2006).

Comments

3 Comments

  1. How can you analyze in the confocal 3D cultures in a 96 well plate?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 12, 2010 - 10:11 AM
  2. Luis - for confocal imaging we recommend plating cultures in glass-bottom dishes or multiwell plates. We have recently described an extensive imaging-based approach for analysis and characterization of growth and treatment response of the 3D cultures in two publications: 1) J. Biomed. Opt., Vol. 15, 051603 (²010); doi:10.1117/1.3483903 and ²) Cancer Res; 70(²²); 9319&#x²013;²8. doi: 10.1158/0008-547².CAN-10-1783

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 12, 2010 - 11:20 AM
  3. how could you extract RNA from this 3D cultures?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 31, 2011 - 11:40 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics