Препарирование органов у взрослых данио рерио

Published 3/04/2010
13 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology
 

Summary

Этот протокол описывает процедуры выявления и рассекает органов у взрослых рыбок данио.

Cite this Article

Copy Citation

Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717, doi:10.3791/1717 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

За последние 20 лет, данио стал мощным организмом модель для понимания развития позвоночных и болезней. Хотя экспериментальный анализ эмбриона и личинки обширна и морфологии была хорошо документирована, описания взрослых данио анатомии и исследований развития взрослого структур и органов, а также приемы работы с взрослым не хватает. Органов личинки претерпевают значительные изменения в их общей структуре, морфологии и анатомического расположения во время личиночной для взрослых перехода. Внешне прозрачные личинки развивает свой характерный полосатый рисунок взрослых пигмента и парных плавников, в то время как внутри страны, органы подвергаются массивной роста и модернизации. Кроме того, bipotential зачаток гонады развивается в любом яичка или яичника. Этот протокол определяет многие из органов взрослых и демонстрирует методы вскрытия головного мозга, половые железы, желудочно-кишечного тракта, сердца и почек у взрослых рыбок данио. Расчлененные органы могут быть использованы для гибридизации на месте, иммуногистохимии, гистология, выделения РНК, белков анализа и других молекулярных методов. Этот протокол будет содействовать расширению исследований в данио включить реконструкцию личиночных органов, морфогенез органов, характерные для взрослого и других исследований взрослых систем организма.

Protocol

  1. Мужской данио будет расчлененный первым, за ним женщина рыбы. Перед началом вскрытия, обезболить рыбы в 0,2% Tricaine а затем усыпить его инкубации в ледяной воде на 15 минут.
  2. Начните слегка похлопывая рыба сушить на бумажное полотенце и размещение его на вскрытии мат. Внешне данио имеют одну спинной, хвостовой и анальный плавники и парные грудные и брюшные плавники (рис. 1).

    Рисунок 1

    Рисунок 1. Взрослый самец рыба с плавниками маркированы.
  3. Pin рыбы рассекает мат через мясистой части хвоста и вентральной части глазницы.
  4. Snip кожи на брюхе рыбы только впереди анального плавника. Вырезать кожи и подлежащих мышцах вдоль живота от анального плавника до жаберной крышки (твердым покрытием более жаберные) (рис. 2, п. 1).

    Рисунок 2

    Рисунок 2. Этапы удаления кожи и мышц стенки тела раскрыть внутренние органы.
  5. Затем удалите жаберной крышки и грудных плавников, в том числе грудного пояса (толстые, костлявые область у основания плавника) (рис. 2, этап 2). Вырезать кожи и подлежащих мышцах начала сверху теперь подвергается жаберных сзади вдоль стороны рыбы, а затем вплоть до анального плавника (рис. 2, пункт 3).
  6. Осторожно снимите кожи и подлежащих мышцах со стороны рыбы. Многие из внутренних органов теперь видны (рис. 3).

    Рисунок 3

    Рисунок 3. Взрослый самец с стенкой тела и мышц позволяет удалить визуализации внутренних органов.
  7. Яички длинные, белые, парных органов, которые прикреплены к спинной стенке тела. Удаление яичка и поместить его в блюдо PBS. Изучить яичка с отраженным светом для визуализации семенных канальцев (рис. 4), которые содержат кисты с различными стадиями развития половых клеток от spermatagonia к сперматиды (Лил и соавт., 2009).

    Рисунок 4

    Рисунок 4. Препарирование яичка. Белый округлый структуры семенных канальцев.
  8. Затем удалите из желудочно-кишечного тракта в полости тела рыбы. Печени можно определить по его большой размер, лопастные морфологии, tannish цвета, а также обширные васкуляризации. Желчного пузыря, зеленые полупрозрачные заполненный жидкостью мешок, и селезенки, которая появляется ярко-красная, находятся в пределах внутренних органов.
  9. Отдельные кишечник от остальных органов и растянуть его. Передний, средних и задних отделах кишечника определяются высоты эпителиальных складок (Wallace и соавт., 2005).
  10. Место кусок кишки в PBS и наблюдать эпителиальные складки использованием проходящем свете.
  11. Далее, рассмотреть плавательного пузыря. Плавательный пузырь состоит из задней камеры, которая связана с пищеводом через пневматическую проток, и передняя камера, которая подключается к внутреннему уху через аппарат Вебера (Финни и соавт., 2006).
  12. Удаляют плавательного пузыря. Изъять рыбы и повторно-контактный его брюшной стороне до рассекают почку, которая расположена вдоль спинной стенке тела. Почка полупрозрачной розовой структурой, связанной с спинной аорты и пигментных клеток. Почке делится на голову, тело и хвост регионов (рис. 5). Рассеките кусок из почек и поместить его в PBS. Tease, кроме почечной ткани выявить почечные канальцы.

    Рисунок 5

    Рисунок 5. Расположение головы, тела и хвоста почку вдоль спинной стенке тела.
  13. Рассеките самка рыбы. Как описано выше, усыпить рыбу в ледяной воде и насухо ему высохнуть, прежде чем закрепление его рассекает мат. Снимите кожу со стороны рыбы, как ранее продемонстрировано. Яичник двухлопастный структуру, которая висит в полости тела по васкуляризированной mesovarium.
  14. Удаление одной доле яичников, поместите его в PBS, и рассмотреть его в проходящем свете. Ооциты могут быть дразнили друг от друга с использованием тонких игл, а затем поставил (рис. 6, Зельман и соавт., 1993). I этап ооциты примерно 10 - 150 мкм и прозрачным. Стадия II ооцитов около 150 - 350 мкм и определяется появление кортикальных гранул. Стадия III ооциты 350 - 750 мкм и непрозрачные из-за накопления желтка. Зрелой стадии IV и V ооциты полупрозрачные и вообще не найден в яичниках самок, которые в последнее время повязана.

    Рисунок 6

    Рисунок 6. Живая стадии I, II, III и ооцитов наблюдалось прирассекает микроскопом в проходящем свете.
  15. Далее рассекают сердце от рыбы. Сердце находится задний и нижний, чтобы жабры. Начните с вырезания сердца, и все окружающие ткани и размещение его в ФБР. Осторожно рассекают от ткани, окружающие сердце, будьте осторожны, чтобы не повредить тонкий атриум.
  16. Место расчлененный сердце в раствор Рингера для наблюдения сердцебиения.
    Определить предсердие, желудочек и артериальный бульбуса (рис. 7, Ху Цзиньтао и соавт., 2001).

    Рисунок 7

    Рисунок 7. Расчлененный взрослого сердца.
  17. Полное вскрытие, удалив мозг от рыбы. Начните с открепления рыбы и удаления головы с лезвия бритвы. Удалите так много мягких тканей как можно дальше от брюшной стороне черепа щипцами. Удалить глаза с помощью небольших ножниц весной. Взламывай череп и удалить кости из брюшной стороне мозга. Теперь поместите голову в блюдо PBS и удалить кожу и кости черепа со спинной стороны головного мозга.
  18. Определить обонятельных луковиц, конечного мозга, уздечка, оптические покрышки, мозжечка и продолговатого мозга (рис. 8, Wullimann и др., 1996;. Шиллинг, 2002).

    Рисунок 8

    Рисунок 8. Расчлененный взрослом мозге рыбок данио. Спинной зрения, впереди сверху.

Disclosures

Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Университета Пенсильвании Институциональные уходу и использованию животных комитета.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана NIH грант R01 HD050901 к MCM и Американского онкологического общества Докторантура стипендий # PF-05-041-01-DDC к ТГ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents:
0.2% Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate)
200 mg tricaine powder
97.9 ml DD water
~1 ml 1 M Tris (pH 9)
Adjust pH to 7.0
Phosphate buffered saline (PBS)
4.0 g NaCl
0.1 g KCl
100 ml 0.1 M PO4 Buffer, pH 7.3
150 ml dH2O
Ringer’s solution
6.7g NaCl
0.2g KCl
0.2g CaCl2
1.2g Hepes
1 L H2O
Adjust pH to 7.2
Dissecting dish with mat Electron Microscopy Sciences 70540
Vannas spring scissors Fine Science Tools 91500-09

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Finney, J. L., Robertson, G. N., McGee, C. A., Smith, F. M., Croll, R. P. Structure and Autonomic Innervation of the Swim Bladder in the Zebrafish (Danio rerio). J Comp Neurol. 495, 587-606 (2006).
  2. Hu, N., Yost, H. J., Clark, E. B. Cardiac morphology and blood pressure in the adult zebrafish. Anat Rec. 264, 1-12 (2001).
  3. Leal, M. C., Cardoso, E. R., Nóbrega, R. H., Batlouni, S. R., Bogerd, J., França, L. R., Schulz, R. W. Histological and stereological evaluation of zebrafish (Danio rerio) spermatogenesis with an emphasis on spermatogonial generations. Biol Reprod. 81, 177-187 (2009).
  4. Schilling, T. F. The morphology of larval and adult zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach (The Practical Approach Series). Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Oxford University Press. (2002).
  5. Selman, K., Wallace, R., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the Zebrafish, Brachydanio rerio. J. Morphol. 218, 203-224 (1993).
  6. Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mech Dev. 122, 157-173 (2005).
  7. Wullimann, M. F., Rupp, B., Reichert, H. Neuroanatomy of the zebrafish brain : a topological atlas. Birkhäuser Verlag. (1996).

Comments

13 Comments

  1. Dear
    Tripti & Mary
    Thanks for such a nice publication. I will be highly obliged if you could send me a full text of this article. I am really impressed by your presentation here.
    I shall be thankful to you
    Cheers
    Avdesh

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 21, 2010 - 4:42 AM
  2. Dear Avdesh,
    Thanks! The article is now OPEN Access, so you should be able to access everything online.
    Mary

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 29, 2010 - 9:57 PM
  3. Congratulation for this well done video. It will be very useful for my students.
    Carla Lucini

    Reply
    Posted by: carla l.
    June 9, 2010 - 3:15 AM
  4. Thank you very much for this very useful presentation.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 16, 2010 - 11:57 AM
  5. Dear
    Tripti & Mary
    First of all congratulations for this well done video..
    My questions are:
    The microscopic aspects of the kidney are similar to human? glomeruli, tubules, interstitium? which part of the kidney should I analyze?
    Thanks
    Antonio

    Reply
    Posted by: michele b.
    August 24, 2010 - 9:56 AM
  6. Dear colleagues Tripti and Mary,
    Thank you very much for your higly professional anatomical and histological investigation as video. It will be very usefull for one of my doctorants.
    But I have got a question: were they wild zebrafish or transgenic ones?
    Sincerely yours,
    Prof. Mikodina Ekaterina Victorovna, Russian Federal Research Institute of Fisheries and Oceanography, Moscow

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 2, 2011 - 7:32 AM
  7. They were wild-type zebrafish.
    Mary

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 2, 2011 - 12:22 PM
  8. Dear Tripti & Mary:
    Thanks for this great work, this is really usefull to me, because i begin my Phd Studies and i will work with zebrafish.
    Regards from Chile!.
    Mario Caruffo.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 28, 2011 - 1:51 AM
  9. Tripti and Mary,

    Thank you for posting this very helpful video. I am considering producing Zebrafish antibodies and this organ dissection study demonstrates that the process of tissue extraction can be done quickly and easily with trained hands.
    Many thanks for your detailed and thorough walk through.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 26, 2011 - 5:28 PM
  10. Dear Tripti and Mary,
    Let me congratulate first...for this great job,
    Know I am confident that we can start our research with Zebra fish.
    Thanks a lot for sharing your knowledge and experience.
    regards
    Rakhi

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 1, 2012 - 6:43 AM
  11. MOHAMED ASIK R


    Thank you for posting this video, I need this video for dissection of zebra fish for toxicity studies. So i pleased to you for sent this video for my research work.
    Thank you.

    Reply
    Posted by: MOHAMED A.
    January 24, 2014 - 7:23 AM
  12. Hello,

    I am trying to identify the gonads in zebrafish and I am wondering at what magnification are figures 4 (testis) and 5 (stages of oocyte) shown.

    Thank you.

    Reply
    Posted by: Jevi A.
    May 12, 2014 - 9:59 PM
  13. thank you for posting this video
    , it was very helpful for my research work

    Reply
    Posted by: Anju t.
    June 15, 2015 - 1:32 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats