Dissection של איברים מן דג הזברה למבוגרים

Published 3/04/2010
13 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology
 

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הליך זיהוי ביתור איברים דג הזברה הבוגרת.

Cite this Article

Copy Citation

Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717, doi:10.3791/1717 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

במהלך 20 השנים האחרונות, דג הזברה הפכה אורגניזם מודל רב עוצמה להבנת התפתחות המחלה לבין החוליות. אמנם ניתוח ניסיוני של העובר ואת הזחל הוא נרחב את המורפולוגיה תועד היטב, תיאורים של אנטומיה דג הזברה מבוגרים מחקרים בהתפתחות של מבנים ואיברים מבוגר, יחד עם טכניקות לעבודה עם מבוגרים חסרים. האיברים של הזחל עוברים שינויים משמעותיים במבנה הכולל שלהם, מורפולוגיה, ואת המיקום האנטומי במהלך הזחל כדי המעבר מבוגר. חיצונית, הזחל מתפתח שקוף המאפיין מבוגרים פסים שלה פיגמנט דפוס סנפירי גחון לזווג, בעוד פנימי, איברים עוברים צמיחה שיפוץ מסיבי. בנוסף, primordium bipotential אשך מתפתח אשך או השחלה. פרוטוקול זה מזהה רבים מן האיברים של המבוגר ומדגים שיטות לניתוח של המוח, בלוטות המין, מערכת העיכול, הלב, הכליות של דג הזברה הבוגרת. איברים גזור ניתן להשתמש ב הכלאה באתרו, בטכניקות מולקולריות אימונוהיסטוכימיה, היסטולוגיה, מיצוי RNA, ניתוח חלבון, ועוד. פרוטוקול זה יסייע הרחבת לימודי דג הזברה לכלול את שיפוץ של איברים הזחל, המורפוגנזה של איברים ספציפיים החקירות בוגרים אחרים של מערכות איברים בוגרים.

Protocol

  1. דג הזברה זכר יהיה גזור הראשון, ואחריו דג ממין נקבה. לפני תחילת הניתוח, להרדים דג Tricaine 0.2% ואז להרדים אותו על ידי הדגירה במי קרח למשך 15 דקות.
  2. בגין, טופח קלות על ידי דג יבש על מגבת נייר והניח אותו על מחצלת לנתח. חיצונית, דג הזברה יש אחד הגבי, סנפירי הזנב ואת אנאלי סנפירי החזה והאגן לזווג (איור 1).

    איור 1

    באיור 1. דג זכר בוגר עם סנפירים שכותרתו.
  3. הצמד את הדגים המחצלת לנתח דרך החלק הבשרי של הזנב ואת החלק הגחוני של ארובת העין.
  4. Snip את העור על הבטן של הדג הקדמי רק סנפיר אנאלי. חותכים את העור, השרירים הבסיסית לאורך הבטן של סנפיר אנאלי operculum (כיסוי קשיח מעל הזימים) (איור 2, שלב 1).

    איור 2

    איור 2. שלבים הסרת העור קיר השרירים בגוף לחשוף את האיברים הפנימיים.
  5. בשלב הבא, להסיר את operculum ואת סנפיר החזה, כולל חגורת החזה (אזור עבה, גרמית בבסיס סנפיר) (איור 2, שלב 2). חותכים את העור ואת תחילת שריר הבסיסית מלמעלה חשוף עכשיו בדיעבד הזימים בצד של הדג, ואז למטה סנפיר אנאלי (איור 2, שלב 3).
  6. בזהירות להסיר את העור ואת השרירים הבסיסית מהצד של הדג. רבים מן האיברים הפנימיים נמצאים כעת גלוי (איור 3).

    איור 3

    איור 3. דג זכר בוגר עם קיר הגוף ושרירים להסיר המאפשר הדמיה של האיברים הפנימיים.
  7. האשכים הם ארוכים, לבנים, איברים לזווג המחוברים לקיר הגוף הגבי. הסרת testis ולמקם אותו בצלחת של PBS. בדוק את testis עם האור המוחזר לדמיין את tubules seminiferous (איור 4), אשר מכילים ציסטות עם השלבים השונים של בתאי הנבט המתפתח מן spermatagonia כדי spermatids (ליאל et al. 2009).

    איור 4

    איור 4. Dissection של אשך. המבנים עגלגל לבן הם tubules seminiferous.
  8. בשלב הבא, להסיר את מערכת העיכול מחלל הגוף של הדג. הכבד ניתן לזהות על ידי גודל גדול שלה, מורפולוגיה אונות, צבע כותונת חומה בהירה, ואת כלי דם רב. כיס המרה, שק ירוק מלאות נוזל שקוף, ואת הטחול, המופיע בצבע אדום בוהק, נמצאים בתוך הקרביים.
  9. הפרד את המעי משאר האיברים ולמתוח אותו. קדמית, אזורים באמצע, ואת האחורי של המעי מוגדרים על ידי גובה של קפלי אפיתל (Wallace et al. 2005).
  10. מניחים פיסת המעי ב PBS ולבחון את קפלי האפיתל באמצעות האור המועבר.
  11. לאחר מכן, לבחון את שלפוחית ​​השחייה. שלפוחית ​​השחייה מורכב בתא האחורי, אשר מחובר אל הוושט באמצעות צינור פנאומטי, וכן תא קדמי, אשר מחובר אל האוזן הפנימית באמצעות המנגנון Weberian (פיני et al. 2006).
  12. הסר לבטל את שלפוחית ​​השחייה. הסר את הדג מחדש פינים זה בצד הגחון עד לנתח את הכליה, הנמצא לאורך הקיר הגוף הגבי. בכליות הוא מבנה ורוד שקוף הקשורים באבי העורקים הגב ותאי פיגמנט. הכליה מחולקת לאזורים ראש, גוף וזנב (איור 5). לנתח את פיסת הכליה ולמקם אותו PBS. ניסתה להפריד רקמות כליה כדי לחשוף את tubules כליות.

    איור 5

    איור 5. מיקום של הראש, הגוף, כליות הזנב לאורך הקיר הגוף הגבי.
  13. לנתח דג ממין נקבה. כפי שתואר קודם לכן, להרדים את הדג במי קרח וללטף לו להתייבש לפני מצמיד אותו למזרן לנתח. הסר את העור מן הצד של הדג כפי שהודגם קודם לכן. השחלה הוא מבנה bilobed כי הוא מושעה בחלל הגוף על ידי mesovarium vascularized.
  14. להסיר את אחד באונה של השחלה, למקם אותו PBS, ולבחון אותה עם האור המועבר. ביציות ניתן התגרו בנפרד באמצעות מחטים דקות ואז מבוים (איור 6, סלמן et al. 1993). אני ביציות שלב כ 10-150 מיקרון ו - שקוף. שלב II ביציות כ 150-350 מיקרון בגודל שהוגדר על ידי הופעתו של גרגרי קליפת המוח. שלב III ביציות הן 350-750 מיקרון והם אטום בשל הצטברות של חלמון. בוגר IV ו-V ביציות בשלב שקופים ובאופן כללי לא נמצא את השחלות של נקבות אשר הזדווגו לא מזמן.

    איור 6

    איור 6. בשלב חי I, II, III ו ביציות שנצפה תחתלנתח מיקרוסקופ עם האור המועבר.
  15. בשלב הבא, לנתח את הלב מן הדגים. הלב ממוקם האחורי ו הגחון של הזימים. בגין על ידי חיתוך את הלב ואת כל הרקמה הסובבת ומעמידים אותו PBS. משם לנתח בזהירות את הרקמה שמסביב ללב, נזהר לא לפגוע אטריום עדין.
  16. מניחים את הלב גזור לתוך הפתרון של רינגר לקיים את פעימות הלב.
    זהה את אטריום, החדר, ואת bulbus arteriosus (איור 7, הו et al., 2001).

    איור 7

    איור 7. ניתח לב מבוגר.
  17. השלם את לנתיחה על ידי הסרת המוח של הדגים. בגין על ידי שלפה את הסיכות את הדגים להסיר את הראש עם סכין גילוח. הסרה של רקמות רכות כמו כמה שיותר מהצד הגחוני של הגולגולת עם מלקחיים. הסר את העיניים בעזרת מספריים מעיין קטן. Break לפתוח את הגולגולת ולהוציא את העצם מהצד הגחוני של המוח. עכשיו מקום ראש בצלחת של PBS ולהסיר את עצמות הגולגולת העור מהצד הגבי של המוח.
  18. זהה את נורות חוש הריח, telencephalon, habenula, tectum אופטיים, המוח הקטן ואת לשד (איור 8, Wullimann et al, 1996;. שילינג, 2002).

    איור 8

    איור 8. ניתח מוח דג הזברה מבוגר. להציג הגבי, קדמית למעלה.

Disclosures

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי האוניברסיטה של ​​פנסילבניה Animal Care מוסדיים ועדת שימוש.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק R01 HD050901 כדי מלמ"ק האמריקאי מלגת האגודה למלחמה בסרטן דוקטורים # PF-05-041-01-DDC כדי TG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents:
0.2% Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate)
200 mg tricaine powder
97.9 ml DD water
~1 ml 1 M Tris (pH 9)
Adjust pH to 7.0
Phosphate buffered saline (PBS)
4.0 g NaCl
0.1 g KCl
100 ml 0.1 M PO4 Buffer, pH 7.3
150 ml dH2O
Ringer’s solution
6.7g NaCl
0.2g KCl
0.2g CaCl2
1.2g Hepes
1 L H2O
Adjust pH to 7.2
Dissecting dish with mat Electron Microscopy Sciences 70540
Vannas spring scissors Fine Science Tools 91500-09

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Finney, J. L., Robertson, G. N., McGee, C. A., Smith, F. M., Croll, R. P. Structure and Autonomic Innervation of the Swim Bladder in the Zebrafish (Danio rerio). J Comp Neurol. 495, 587-606 (2006).
  2. Hu, N., Yost, H. J., Clark, E. B. Cardiac morphology and blood pressure in the adult zebrafish. Anat Rec. 264, 1-12 (2001).
  3. Leal, M. C., Cardoso, E. R., Nóbrega, R. H., Batlouni, S. R., Bogerd, J., França, L. R., Schulz, R. W. Histological and stereological evaluation of zebrafish (Danio rerio) spermatogenesis with an emphasis on spermatogonial generations. Biol Reprod. 81, 177-187 (2009).
  4. Schilling, T. F. The morphology of larval and adult zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach (The Practical Approach Series). Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Oxford University Press. (2002).
  5. Selman, K., Wallace, R., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the Zebrafish, Brachydanio rerio. J. Morphol. 218, 203-224 (1993).
  6. Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mech Dev. 122, 157-173 (2005).
  7. Wullimann, M. F., Rupp, B., Reichert, H. Neuroanatomy of the zebrafish brain : a topological atlas. Birkhäuser Verlag. (1996).

Comments

13 Comments

  1. Dear
    Tripti & Mary
    Thanks for such a nice publication. I will be highly obliged if you could send me a full text of this article. I am really impressed by your presentation here.
    I shall be thankful to you
    Cheers
    Avdesh

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 21, 2010 - 4:42 AM
  2. Dear Avdesh,
    Thanks! The article is now OPEN Access, so you should be able to access everything online.
    Mary

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 29, 2010 - 9:57 PM
  3. Congratulation for this well done video. It will be very useful for my students.
    Carla Lucini

    Reply
    Posted by: carla l.
    June 9, 2010 - 3:15 AM
  4. Thank you very much for this very useful presentation.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 16, 2010 - 11:57 AM
  5. Dear
    Tripti & Mary
    First of all congratulations for this well done video..
    My questions are:
    The microscopic aspects of the kidney are similar to human? glomeruli, tubules, interstitium? which part of the kidney should I analyze?
    Thanks
    Antonio

    Reply
    Posted by: michele b.
    August 24, 2010 - 9:56 AM
  6. Dear colleagues Tripti and Mary,
    Thank you very much for your higly professional anatomical and histological investigation as video. It will be very usefull for one of my doctorants.
    But I have got a question: were they wild zebrafish or transgenic ones?
    Sincerely yours,
    Prof. Mikodina Ekaterina Victorovna, Russian Federal Research Institute of Fisheries and Oceanography, Moscow

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 2, 2011 - 7:32 AM
  7. They were wild-type zebrafish.
    Mary

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 2, 2011 - 12:22 PM
  8. Dear Tripti & Mary:
    Thanks for this great work, this is really usefull to me, because i begin my Phd Studies and i will work with zebrafish.
    Regards from Chile!.
    Mario Caruffo.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 28, 2011 - 1:51 AM
  9. Tripti and Mary,

    Thank you for posting this very helpful video. I am considering producing Zebrafish antibodies and this organ dissection study demonstrates that the process of tissue extraction can be done quickly and easily with trained hands.
    Many thanks for your detailed and thorough walk through.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 26, 2011 - 5:28 PM
  10. Dear Tripti and Mary,
    Let me congratulate first...for this great job,
    Know I am confident that we can start our research with Zebra fish.
    Thanks a lot for sharing your knowledge and experience.
    regards
    Rakhi

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 1, 2012 - 6:43 AM
  11. MOHAMED ASIK R


    Thank you for posting this video, I need this video for dissection of zebra fish for toxicity studies. So i pleased to you for sent this video for my research work.
    Thank you.

    Reply
    Posted by: MOHAMED A.
    January 24, 2014 - 7:23 AM
  12. Hello,

    I am trying to identify the gonads in zebrafish and I am wondering at what magnification are figures 4 (testis) and 5 (stages of oocyte) shown.

    Thank you.

    Reply
    Posted by: Jevi A.
    May 12, 2014 - 9:59 PM
  13. thank you for posting this video
    , it was very helpful for my research work

    Reply
    Posted by: Anju t.
    June 15, 2015 - 1:32 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats