Dissection von Organen aus dem Adult Zebrafisch

Published 3/04/2010
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Biology
 

Summary

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Identifizierung und seziert Organe von den erwachsenen Zebrafisch.

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Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717, doi:10.3791/1717 (2010).

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Abstract

In den letzten 20 Jahren hat sich der Zebrafisch zu einem leistungsfähigen Modell-Organismus für das Verständnis der Entwicklung von Wirbeltieren und Krankheit. Obwohl experimentelle Analyse des Embryos und Larven ist sehr umfangreich und die Morphologie ist gut dokumentiert, sind die Beschreibungen der erwachsenen Zebrafisch Anatomie und Studien über die Entwicklung der erwachsenen Strukturen und Organe, zusammen mit Techniken für die Arbeit mit Erwachsenen fehlen. Die Organe der Larve eine bedeutende Veränderung in ihrer gesamten Struktur, Morphologie und anatomische Lage während des Larven zu erwachsenen Übergang. Äußerlich entwickelt die transparente Larve ihren charakteristischen Erwachsenen gestreiften Pigment Muster und gepaart Bauchflossen, während intern die Organe zu unterziehen massives Wachstum und Umbau. Darüber hinaus entwickelt die bipotentialen Geschlechtsdrüse Primordium entweder in Hoden oder Eierstock. Dieses Protokoll enthält viele Organe des Erwachsenen und zeigt Methoden für die Präparation des Gehirns, Gonaden, Magen-Darm-System, Herz und Niere des erwachsenen Zebrafisch. Die sezierten Organe können in-situ-Hybridisierung, Immunhistochemie, Histologie, RNA-Extraktion, Protein-Analyse und andere molekulare Techniken eingesetzt werden. Dieses Protokoll wird in die Erweiterung der Studien im Zebrafisch zu helfen, den Umbau des larvalen Organe, die Morphogenese von Organen spezifisch für die Erwachsenen und andere Untersuchungen der erwachsenen Organsysteme umfassen.

Protocol

  1. Ein männlicher Zebrafisch wird zuerst zerlegt werden, gefolgt von einer weiblichen Fische. Vor Beginn der Dissektion, betäuben ein Fisch in 0,2% Tricaine und dann einschläfern es durch Inkubation in Eiswasser für 15 Minuten.
  2. Beginnen Sie mit dem leicht klopfen die Fische trocken auf einem Papiertuch und legt es auf dem Seziertisch Matte. Äußerlich haben Zebrafisch einzigen dorsalen, Schwanz-und Afterflossen und gepaart Brust-und Bauchflossen (Abbildung 1).

    Abbildung 1

    Abbildung 1. Erwachsene männliche Fische mit Flossen gekennzeichnet.
  3. Pin die Fische auf die Matte Sezieren durch den fleischigen Teil des Schwanzes und der ventrale Teil der Augenhöhle.
  4. Snip die Haut an den Bauch des Fisches knapp vor der Afterflosse. Schneiden Sie die Haut und darunter liegende Muskulatur entlang der Bauch von der Afterflosse, die Operculum (die harte Abdeckung über der Kiemen) (Abbildung 2, Stufe 1).

    Abbildung 2

    Abbildung 2. Steps bei der Beseitigung von Haut und Körper Wand Muskulatur der inneren Organe freizulegen.
  5. Dann entfernen Sie das Operculum und die Brustflosse, einschließlich der Schultergürtel (die dicken, knöchernen Region an der Basis des fin) (Abbildung 2, Schritt 2). Schneiden Sie die Haut und darunter liegende Muskulatur zu Beginn von oben der nun freiliegenden Kiemen hinten an der Seite des Fisches und dann auf der Afterflosse (Abb. 2, Schritt 3).
  6. Entfernen Sie vorsichtig die Haut und darunter liegende Muskulatur von der Seite des Fisches. Viele der inneren Organe sind jetzt sichtbar (Abbildung 3).

    Abbildung 3

    Abbildung 3. Erwachsene männliche Fische mit Körperwand und Muskulatur entfernt ermöglicht die Visualisierung der inneren Organe.
  7. Die Hoden sind lang, weiß, gepaart Organe, die an der dorsalen Körperwand befestigt sind. Entfernen eines Hodens und legen Sie sie in eine Schüssel mit PBS. Untersuchen Sie die Hoden mit reflektiertem Licht zu den Samenkanälchen (Abbildung 4), die Zysten enthalten mit verschiedenen Stadien der Entwicklung von Keimzellen aus spermatagonia zu Spermatiden (Leal et al., 2009) zu visualisieren.

    Abbildung 4

    Abbildung 4. Dissection eines Hodens. Die weißen rundlichen Strukturen sind die Samenleiter.
  8. Dann entfernen Sie den Magen-Darm-System aus der Körperhöhle des Fisches. Die Leber kann durch seine Größe, gelappt Morphologie, bräunlichen Farbe und umfangreiche Vaskularisierung identifiziert werden. Die Gallenblase, eine grüne durchscheinende Flüssigkeit gefüllten Sack, und die Milz, die leuchtend rot erscheint, sind in den Eingeweiden gefunden.
  9. Separate den Darm aus dem Rest der Organe und auszustrecken. Die vorderen, mittleren und hinteren Regionen des Darms werden durch die Höhe der epithelialen Falten (Wallace et al., 2005) definiert.
  10. Legen Sie ein Stück des Darms in PBS und beobachten Sie die epithelialen Falten mit Durchlicht.
  11. Als nächstes untersuchen die Schwimmblase. Die Schwimmblase besteht aus einer hinteren Kammer, die an der Speiseröhre über den pneumatischen Kanal, und eine vordere Kammer, die an das Innenohr durch den Weberschen Apparat (Finney et al., 2006) ist in Verbindung steht.
  12. Entfernen und Entsorgen der Schwimmblase. Unpin die Fische und re-pin es Bauchseite bis zu den Nieren, die sich entlang der dorsalen Körperwand befindet sezieren. Die Niere ist ein durchsichtiges Rosa-Struktur mit der dorsalen Aorta und pigmentierten Zellen assoziiert. Die Niere ist in Kopf, Körper und Schwanz Regionen (Abbildung 5) unterteilt. Dissect ein Stück der Niere und legen Sie sie in PBS. Tease neben dem Nierengewebe der Nierentubuli zu offenbaren.

    Abbildung 5

    Abbildung 5. Lage der Kopf, Körper und Schwanz Nieren entlang der dorsalen Körperwand.
  13. Sezieren einen weiblichen Fisch. Wie zuvor beschrieben, euthanize die Fische in Eiswasser und pat es trocken ist, bevor Pinning es dem Sezieren Matte. Entfernen Sie die Haut von der Seite des Fisches, wie zuvor gezeigt. Der Eierstock ist ein bilobed Struktur, die in der Leibeshöhle durch einen vaskularisierten Mesovarium ausgesetzt ist.
  14. Nehmen Sie einen Lappen des Eierstocks, legen Sie sie in PBS, und prüfen Sie mit Durchlicht. Die Eizellen können neben gehänselt werden mit feinen Nadeln und dann inszeniert (Abbildung 6, Selman et al., 1993). Stage I Eizellen sind ca. 10 bis 150 Mikrometer groß und durchscheinend. Stage II-Oozyten sind etwa 150 bis 350 Mikrometer groß und definiert durch das Auftreten von kortikalen Granula. Stadium III Oozyten sind 350 bis 750 Mikrometer groß und undurchsichtig sind aufgrund der Ansammlung von Dotter. Reifen Stadium IV und V Eizellen sind lichtdurchlässig und in der Regel nicht in den Eierstöcken der Frauen, die vor kurzem gepaart gefunden haben.

    Abbildung 6

    Abbildung 6. Live Stadium I, II, III und Eizellen unter einem beobachtetenBinokular mit Durchlicht.
  15. Als nächstes zerlegen das Herz aus dem Fisch. Das Herz befindet sich posterior und ventral der Kiemen. Beginnen Sie mit dem Herausschneiden des Herzens und all das umliegende Gewebe und es in PBS. Sorgfältig sezieren weg das Gewebe rund um das Herz, darauf achten, daß die zarte Atrium Schäden.
  16. Setzen Sie den sezierten Herzen in Ringer-Lösung, um den Herzschlag zu beobachten.
    Identifizieren Sie die Atrium, Ventrikel und Bulbus arteriosus (Abb. 7, Hu et al., 2001).

    Abbildung 7

    Abbildung 7. Dissected erwachsenen Herzens.
  17. Füllen Sie das Sezieren, indem das Gehirn aus dem Fisch. Beginnen Sie mit der unpinning die Fische und das Entfernen der Kopf mit einer Rasierklinge. Entfernen Sie so viel Weichgewebe wie möglich von der Bauchseite des Schädels mit einer Pinzette. Entfernen Sie die Augen mit kleinen Feder Schere. Brechen Sie den Schädel und entfernen Sie die Knochen aus dem ventralen Seite des Gehirns. Setzen Sie nun den Kopf in eine Schüssel mit PBS und die Haut abziehen und Schädelknochen von der dorsalen Seite des Gehirns.
  18. Identifizieren Sie die Riechkolben, Telencephalon, Habenula, Tectum opticum, Cerebellum und Medulla (Abbildung 8, Wullimann et al, 1996;. Schilling, 2002).

    Abbildung 8

    Abbildung 8. Dissected erwachsenen Zebrafisch Gehirn. Dorsalansicht, anterior nach oben.

Disclosures

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der University of Pennsylvania Institutional Animal Care und Verwenden Ausschusses durchgeführt.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde vom NIH R01 HD050901 zu MCM und American Cancer Society Postdoctoral Fellowship # PF-05-041 bis 01-DDC zur TG unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents:
0.2% Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate)
200 mg tricaine powder
97.9 ml DD water
~1 ml 1 M Tris (pH 9)
Adjust pH to 7.0
Phosphate buffered saline (PBS)
4.0 g NaCl
0.1 g KCl
100 ml 0.1 M PO4 Buffer, pH 7.3
150 ml dH2O
Ringer’s solution
6.7g NaCl
0.2g KCl
0.2g CaCl2
1.2g Hepes
1 L H2O
Adjust pH to 7.2
Dissecting dish with mat Electron Microscopy Sciences 70540
Vannas spring scissors Fine Science Tools 91500-09

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Finney, J. L., Robertson, G. N., McGee, C. A., Smith, F. M., Croll, R. P. Structure and Autonomic Innervation of the Swim Bladder in the Zebrafish (Danio rerio). J Comp Neurol. 495, 587-606 (2006).
  2. Hu, N., Yost, H. J., Clark, E. B. Cardiac morphology and blood pressure in the adult zebrafish. Anat Rec. 264, 1-12 (2001).
  3. Leal, M. C., Cardoso, E. R., Nóbrega, R. H., Batlouni, S. R., Bogerd, J., França, L. R., Schulz, R. W. Histological and stereological evaluation of zebrafish (Danio rerio) spermatogenesis with an emphasis on spermatogonial generations. Biol Reprod. 81, 177-187 (2009).
  4. Schilling, T. F. The morphology of larval and adult zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach (The Practical Approach Series). Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Oxford University Press. (2002).
  5. Selman, K., Wallace, R., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the Zebrafish, Brachydanio rerio. J. Morphol. 218, 203-224 (1993).
  6. Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mech Dev. 122, 157-173 (2005).
  7. Wullimann, M. F., Rupp, B., Reichert, H. Neuroanatomy of the zebrafish brain : a topological atlas. Birkhäuser Verlag. (1996).

Comments

13 Comments

  1. Dear
    Tripti & Mary
    Thanks for such a nice publication. I will be highly obliged if you could send me a full text of this article. I am really impressed by your presentation here.
    I shall be thankful to you
    Cheers
    Avdesh

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 21, 2010 - 4:42 AM
  2. Dear Avdesh,
    Thanks! The article is now OPEN Access, so you should be able to access everything online.
    Mary

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 29, 2010 - 9:57 PM
  3. Congratulation for this well done video. It will be very useful for my students.
    Carla Lucini

    Reply
    Posted by: carla l.
    June 9, 2010 - 3:15 AM
  4. Thank you very much for this very useful presentation.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 16, 2010 - 11:57 AM
  5. Dear
    Tripti & Mary
    First of all congratulations for this well done video..
    My questions are:
    The microscopic aspects of the kidney are similar to human? glomeruli, tubules, interstitium? which part of the kidney should I analyze?
    Thanks
    Antonio

    Reply
    Posted by: michele b.
    August 24, 2010 - 9:56 AM
  6. Dear colleagues Tripti and Mary,
    Thank you very much for your higly professional anatomical and histological investigation as video. It will be very usefull for one of my doctorants.
    But I have got a question: were they wild zebrafish or transgenic ones?
    Sincerely yours,
    Prof. Mikodina Ekaterina Victorovna, Russian Federal Research Institute of Fisheries and Oceanography, Moscow

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 2, 2011 - 7:32 AM
  7. They were wild-type zebrafish.
    Mary

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 2, 2011 - 12:22 PM
  8. Dear Tripti & Mary:
    Thanks for this great work, this is really usefull to me, because i begin my Phd Studies and i will work with zebrafish.
    Regards from Chile!.
    Mario Caruffo.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 28, 2011 - 1:51 AM
  9. Tripti and Mary,

    Thank you for posting this very helpful video. I am considering producing Zebrafish antibodies and this organ dissection study demonstrates that the process of tissue extraction can be done quickly and easily with trained hands.
    Many thanks for your detailed and thorough walk through.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 26, 2011 - 5:28 PM
  10. Dear Tripti and Mary,
    Let me congratulate first...for this great job,
    Know I am confident that we can start our research with Zebra fish.
    Thanks a lot for sharing your knowledge and experience.
    regards
    Rakhi

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 1, 2012 - 6:43 AM
  11. MOHAMED ASIK R


    Thank you for posting this video, I need this video for dissection of zebra fish for toxicity studies. So i pleased to you for sent this video for my research work.
    Thank you.

    Reply
    Posted by: MOHAMED A.
    January 24, 2014 - 7:23 AM
  12. Hello,

    I am trying to identify the gonads in zebrafish and I am wondering at what magnification are figures 4 (testis) and 5 (stages of oocyte) shown.

    Thank you.

    Reply
    Posted by: Jevi A.
    May 12, 2014 - 9:59 PM
  13. thank you for posting this video
    , it was very helpful for my research work

    Reply
    Posted by: Anju t.
    June 15, 2015 - 1:32 PM

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