Dissezione di organi dal Zebrafish adulti

Published 3/04/2010
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Biology
 

Summary

Questo protocollo descrive una procedura per l'individuazione e organi da sezionare il pesce zebra adulto.

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Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717, doi:10.3791/1717 (2010).

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Abstract

Negli ultimi 20 anni, il pesce zebra è diventato un organismo modello potente per la comprensione dello sviluppo dei vertebrati e le malattie. Anche se l'analisi sperimentale degli embrioni e larve è ampia e la morfologia è stato ben documentato, descrizioni di anatomia zebrafish adulti e studi di sviluppo delle strutture per adulti e degli organi, insieme alle tecniche per lavorare con gli adulti sono carenti. Gli organi della larva subire importanti cambiamenti nella loro struttura complessiva, la morfologia e la posizione anatomica durante le larve di transizione per adulti. Esternamente, la larva trasparente sviluppa il suo modello caratteristico pigmento strisce adulti e coppie pinne pelviche, mentre internamente, gli organi subiscono un'enorme crescita e rimodellamento. Inoltre, il primordio bipotential gonade si sviluppa in entrambi i testicoli o ovaie. Questo protocollo identifica molti degli organi degli adulti e vengono utilizzati dei metodi per la dissezione del cervello, gonadi, apparato gastrointestinale, cuore, reni e del pesce zebra adulto. Gli organi sezionati può essere utilizzato per l'ibridazione in situ, tecniche di immunoistochimica, istologia, estrazione di RNA, analisi delle proteine, e altri molecolare. Questo protocollo aiuterà a l'ampliamento di studi nel zebrafish per includere la ristrutturazione degli organi larvali, la morfogenesi degli organi specifici per le indagini adulti e altri sistemi di organi adulti.

Protocol

  1. Un pesce zebra maschio sarà sezionato per primo, seguito da un pesce femmina. Prima di iniziare la dissezione, anestetizzare un pesce nello 0,2% Tricaine e poi l'eutanasia dalla incubazione in acqua ghiacciata per 15 minuti.
  2. Iniziare con una leggera accarezzando il pesce secco su un tovagliolo di carta e posizionarlo su una stuoia dissezione. Esternamente, pesce zebra hanno un'unica dorsale, pinna caudale e anale e associato pinne pettorali e pelviche (Figura 1).

    Figura 1

    Figura 1. Adulto pesci di sesso maschile con le pinne etichettati.
  3. Pin il pesce al tappeto dissezione attraverso la parte carnosa della coda e la parte ventrale della cavità oculare.
  4. Tagliare la pelle del ventre del pesce appena anteriormente alla pinna anale. Tagliare la pelle e il muscolo sottostante lungo il ventre dalla pinna anale per l'opercolo (il rivestimento duro sopra la branchia) (Figura 2, punto 1).

    Figura 2

    Figura 2. Passi nella rimozione della pelle e la parete muscolare del corpo per esporre gli organi interni.
  5. Quindi, rimuovere l'opercolo e la pinna pettorale, tra cui la cintura pettorale (la spessa, regione ossea alla base della pinna) (Figura 2, punto 2). Tagliare la pelle e l'inizio del muscolo sottostante dall'alto del ora esposti branchie posteriormente lungo il lato del pesce e poi giù per la pinna anale (Figura 2, punto 3).
  6. Rimuovere con cura la pelle e muscolo sottostante dal lato del pesce. Molti degli organi interni sono ora visibili (Figura 3).

    Figura 3

    Figura 3. Pesci adulti di sesso maschile con la parete del corpo e dei muscoli rimossi permettendo la visualizzazione degli organi interni.
  7. I testicoli sono lunghe, bianche, organi accoppiati che sono attaccate alla parete dorsale del corpo. Rimuovere un testicolo e mettetelo in un piatto di PBS. Esaminare il testicolo di luce riflessa di visualizzare i tubuli seminiferi (Figura 4), che contengono le cisti con varie fasi di sviluppo di cellule germinali da spermatagonia a spermatidi (Leal et al., 2009).

    Figura 4

    Figura 4. Dissezione di un testicolo. Le strutture bianche tondeggianti sono i tubuli seminiferi.
  8. Quindi, rimuovere il sistema gastrointestinale dalla cavità del corpo del pesce. Il fegato può essere identificato per le grandi dimensioni, morfologia lobi, colore tannish, e la vascolarizzazione estesa. La colecisti, un verde traslucido sacco pieno di liquido, e la milza, che appare rosso vivo, si trovano all'interno del viscere.
  9. Separare l'intestino dal resto degli organi e tratto fuori. L'anteriore, le regioni a metà, e posteriore dell'intestino sono definiti da l'altezza delle pieghe epiteliali (Wallace et al., 2005).
  10. Posizionare un pezzo di intestino in PBS e osservare le pieghe epiteliali a luce trasmessa.
  11. Successivamente, esaminare la vescica natatoria. La vescica natatoria è costituito da una camera posteriore, che è collegato all'esofago attraverso il dotto pneumatico, e una camera anteriore, che è collegata all'orecchio interno attraverso l'apparato weberiano (Finney et al., 2006).
  12. Rimuovere e gettare la vescica natatoria. Sblocca il pesce e ri-pin che lato ventrale fino a sezionare il rene, che si trova lungo la parete del corpo dorsale. Il rene è una struttura trasparente rosa, associata con l'aorta dorsale e cellule pigmentate. Il rene è suddiviso in regioni della testa, corpo e coda (Figura 5). Sezionare un pezzo del rene e metterlo in PBS. Prendere in giro a parte il tessuto renale per rivelare i tubuli renali.

    Figura 5

    Figura 5. Posizione testa, corpo, e rene coda lungo la parete dorsale del corpo.
  13. Sezionare un pesce femmina. Come descritto in precedenza, l'eutanasia il pesce in acqua ghiacciata e pat asciugare prima di pinning al tappeto dissezione. Togliere la pelle dal lato del pesce come precedentemente dimostrato. L'ovaio è una struttura bilobata che è sospeso nella cavità del corpo da un mesovarium vascolarizzato.
  14. Rimuovere un lobo delle ovaie, è posto in PBS, ed esaminarlo con luce trasmessa. Gli ovociti possono essere presi in giro a parte utilizzando aghi sottili e poi messo in scena (Figura 6, Selman et al., 1993). Stadio I ovociti sono circa 10 - 150 micron di dimensione e traslucido. Ovociti fase II sono circa 150 - 350 micron nel formato e definito dalla comparsa di granuli corticali. Ovociti stadio III sono 350-750 micron e sono opachi a causa dell'accumulo di tuorlo. Ovociti maturi stadio IV e V sono trasparenti e generalmente non si trovano nelle ovaie delle femmine che hanno recentemente accoppiato.

    Figura 6

    Figura 6. Palco dal vivo I, II, III e ovociti osservati sotto undissezione microscopio a luce trasmessa.
  15. Successivamente, sezionare il cuore dal pesce. Il cuore si trova posteriore e ventrale alla branchia. Iniziate tagliando fuori il cuore e tutto il tessuto circostante e mettendolo in PBS. Con attenzione sezionare via il tessuto che circonda il cuore, facendo attenzione a non danneggiare l'atrio delicato.
  16. Mettere il cuore sezionato in soluzione di Ringer per osservare il battito cardiaco.
    Identificare l'atrio, ventricolo e bulbo arterioso (Figura 7, Hu et al., 2001).

    Figura 7

    Figura 7. Dissected cuore adulto.
  17. Completa la dissezione rimuovendo il cervello dal pesce. Inizia unpinning il pesce e la rimozione della testa con una lama di rasoio. Rimuovere il più possibile i tessuti molli dal lato ventrale del cranio con una pinza. Rimuovere gli occhi con le forbici piccola sorgente. Rompere il cranio e togliere l'osso dalla parte ventrale del cervello. Ora posto la testa in un piatto di PBS e togliere la pelle e le ossa del cranio dal lato dorsale del cervello.
  18. Identificare i bulbi olfattivi, telencefalo, habenula, tetto ottico, cervelletto e midollo (Figura 8, Wullimann et al, 1996;. Schilling, 2002).

    Figura 8

    Figura 8. Dissected zebrafish cervello adulto. Vista dorsale, anteriore verso l'alto.

Disclosures

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dalla University of Animal Care Pennsylvania e del Comitato Istituzionale Usa.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere R01 HD050901 di MCM e americana Cancer Society Postdoctoral Fellowship # PF-05-041-01-DDC al TG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents:
0.2% Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate)
200 mg tricaine powder
97.9 ml DD water
~1 ml 1 M Tris (pH 9)
Adjust pH to 7.0
Phosphate buffered saline (PBS)
4.0 g NaCl
0.1 g KCl
100 ml 0.1 M PO4 Buffer, pH 7.3
150 ml dH2O
Ringer’s solution
6.7g NaCl
0.2g KCl
0.2g CaCl2
1.2g Hepes
1 L H2O
Adjust pH to 7.2
Dissecting dish with mat Electron Microscopy Sciences 70540
Vannas spring scissors Fine Science Tools 91500-09

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Finney, J. L., Robertson, G. N., McGee, C. A., Smith, F. M., Croll, R. P. Structure and Autonomic Innervation of the Swim Bladder in the Zebrafish (Danio rerio). J Comp Neurol. 495, 587-606 (2006).
  2. Hu, N., Yost, H. J., Clark, E. B. Cardiac morphology and blood pressure in the adult zebrafish. Anat Rec. 264, 1-12 (2001).
  3. Leal, M. C., Cardoso, E. R., Nóbrega, R. H., Batlouni, S. R., Bogerd, J., França, L. R., Schulz, R. W. Histological and stereological evaluation of zebrafish (Danio rerio) spermatogenesis with an emphasis on spermatogonial generations. Biol Reprod. 81, 177-187 (2009).
  4. Schilling, T. F. The morphology of larval and adult zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach (The Practical Approach Series). Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Oxford University Press. (2002).
  5. Selman, K., Wallace, R., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the Zebrafish, Brachydanio rerio. J. Morphol. 218, 203-224 (1993).
  6. Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mech Dev. 122, 157-173 (2005).
  7. Wullimann, M. F., Rupp, B., Reichert, H. Neuroanatomy of the zebrafish brain : a topological atlas. Birkhäuser Verlag. (1996).

Comments

13 Comments

  1. Dear
    Tripti & Mary
    Thanks for such a nice publication. I will be highly obliged if you could send me a full text of this article. I am really impressed by your presentation here.
    I shall be thankful to you
    Cheers
    Avdesh

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 21, 2010 - 4:42 AM
  2. Dear Avdesh,
    Thanks! The article is now OPEN Access, so you should be able to access everything online.
    Mary

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 29, 2010 - 9:57 PM
  3. Congratulation for this well done video. It will be very useful for my students.
    Carla Lucini

    Reply
    Posted by: carla l.
    June 9, 2010 - 3:15 AM
  4. Thank you very much for this very useful presentation.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 16, 2010 - 11:57 AM
  5. Dear
    Tripti & Mary
    First of all congratulations for this well done video..
    My questions are:
    The microscopic aspects of the kidney are similar to human? glomeruli, tubules, interstitium? which part of the kidney should I analyze?
    Thanks
    Antonio

    Reply
    Posted by: michele b.
    August 24, 2010 - 9:56 AM
  6. Dear colleagues Tripti and Mary,
    Thank you very much for your higly professional anatomical and histological investigation as video. It will be very usefull for one of my doctorants.
    But I have got a question: were they wild zebrafish or transgenic ones?
    Sincerely yours,
    Prof. Mikodina Ekaterina Victorovna, Russian Federal Research Institute of Fisheries and Oceanography, Moscow

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 2, 2011 - 7:32 AM
  7. They were wild-type zebrafish.
    Mary

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 2, 2011 - 12:22 PM
  8. Dear Tripti & Mary:
    Thanks for this great work, this is really usefull to me, because i begin my Phd Studies and i will work with zebrafish.
    Regards from Chile!.
    Mario Caruffo.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 28, 2011 - 1:51 AM
  9. Tripti and Mary,

    Thank you for posting this very helpful video. I am considering producing Zebrafish antibodies and this organ dissection study demonstrates that the process of tissue extraction can be done quickly and easily with trained hands.
    Many thanks for your detailed and thorough walk through.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 26, 2011 - 5:28 PM
  10. Dear Tripti and Mary,
    Let me congratulate first...for this great job,
    Know I am confident that we can start our research with Zebra fish.
    Thanks a lot for sharing your knowledge and experience.
    regards
    Rakhi

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 1, 2012 - 6:43 AM
  11. MOHAMED ASIK R


    Thank you for posting this video, I need this video for dissection of zebra fish for toxicity studies. So i pleased to you for sent this video for my research work.
    Thank you.

    Reply
    Posted by: MOHAMED A.
    January 24, 2014 - 7:23 AM
  12. Hello,

    I am trying to identify the gonads in zebrafish and I am wondering at what magnification are figures 4 (testis) and 5 (stages of oocyte) shown.

    Thank you.

    Reply
    Posted by: Jevi A.
    May 12, 2014 - 9:59 PM
  13. thank you for posting this video
    , it was very helpful for my research work

    Reply
    Posted by: Anju t.
    June 15, 2015 - 1:32 PM

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