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激活的B细胞CD40的小鼠模型

Immunology and Infection

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Summary

在这个视频中,我们展示的CD40从C57BL / 6小鼠的脾细胞,它可以用来作为模型抗原提呈细胞(APC)的研究免疫诱导小鼠的B细胞的活化和扩大的过程。

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Liebig, T. M., Fiedler, A., Klein-Gonzalez, N., Shimabukuro-Vornhagen, A., von Bergwelt-Baildon, M. Murine Model of CD40-activation of B cells. J. Vis. Exp. (37), e1734, doi:10.3791/1734 (2010).

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Abstract

有研究表明,B细胞CD40的激活提高其抗原提呈能力。当白细胞介素4和CD40配体(CD40L)的刺激下,没有非常大量高纯度的CD40 - B细胞(14天之内的困难,从少量外周血的可扩展人类B细胞> 10

Protocol

协议分为两个部分:第一部分为一代小鼠CD40激活的B细胞(脾mCD40B)一个演示小鼠CD40配体(CD40L)表达HeLa细胞(tmuCD40L HeLa细胞),这将被用作板准备束缚饲养层细胞。 B部分介绍了实际的小鼠CD40 - B的文化。

A.制备饲养细胞(HeLa细胞tmuCD40L)

tmuCD40L HeLa细胞是一个附着的人类上皮细胞系,这不应该成为完全融合。因此,这些细胞被劈裂每周两次。超过6周以上的培养,不推荐。

  1. 从小学文化的老媒体取出,用无菌吸管和10 mL 1X PBS中洗细胞。吸的PBS洗涤后。
  2. 添加4毫升1X胰蛋白酶/ EDTA,在一个75厘米 2瓶10-15分钟,在37 ° C。使用温柔攻分离的细胞。
  3. 野生型中添加10毫升,并轻轻旋转停止用胰酶消化。
  4. 转移到50 mL试管细胞悬液,用无菌吸管和旋转265 7分钟XG的细胞。
  5. 去除上清,重悬细胞沉淀在野生型中的10毫升。计数细胞悬液等分的细胞数,并准备适当数量的细胞50毫升管:
    1. 2.5 × 10 6细胞对亚文化
    2. 0.4 × 10 6细胞/孔照射小鼠CD40 - B细胞培养使用
    3. 其余冻结(如需要)。
  6. 旋转细胞在265 7分钟XG。
  7. 去除上清。
    1. 传代培养:重悬于2.5 × 10 6细胞10毫升,75厘米2细胞培养瓶中的选择培养基(细胞密度为2.5 × 10 5细胞/ mL)孵育细胞在37℃,5%的CO 2 。每周两次分裂的细胞。
    2. 对于小鼠CD40 - B细胞文化:您需要2.4 × 10 6 6孔板细胞。在野生型中重悬tmuCD40L HeLa细胞密度0.2 × 10 6细胞/ mL,他们在78 Gy的照射。板2毫升细胞悬液,每口井,并在37℃,5%的CO 2。使用B -细胞的刺激,这准备板块tmuCD40L HeLa细胞是贴壁时(至少4个小时:用显微镜检查坚持;不要等到超过24 h开始的B细胞刺激)。 (继续与B)

B.小鼠CD40 - B细胞培养

一,制备脾细胞CD40的刺激(0天):

请注意:在继续之前确定,饲养层细胞是贴壁。随时添加新的解决办法小鼠白细胞介素- 4,β-巯基乙醇和环孢素A的生长介质,使用前。

  1. 剖析的C57BL / 6小鼠(H - 2B单体)的脾和10-20毫升的DMEM洗两次辅以庆大霉素[15μg/mL]一个10毫升吸管尖从一个管到另一个传输。避免使用鼠标的传输污染物(例如头发)。切碎脾细胞通过一个过滤器(100微米)通过,并与其他10毫升的中型冲洗过滤器。降速在室温下为7分钟在265 XG脾,重悬在7ML muCD40 - B细胞中,并Ficoll密度离心分离淋巴细胞。没有在室温下刹车,这样做的5毫升鼠标Pancoll(在室温预热)在15毫升管和离心30分钟XG 450层细胞。
  2. 绘制关闭最上层,离开淋巴细胞在界面层不受干扰。淋巴细胞层转移到一个新的50 mL试管中,用30毫升,庆大霉素[15μg/mL] DMEM培养液一旦被旋转265 7分钟XG删除其他细胞。弃上清,重悬细胞mCD40 - B的清洗介质在10毫升的。确定细胞的细胞悬液分装数。确定由计数的细胞悬液等分细胞数。
  3. 离心7分钟在265 XG的细胞所需的金额。对于6孔板5 × 10 6细胞/孔的需要,因此30 × 10 6细胞每盘。
  4. 取出上清液,重悬mCD40 - B的文化与1 U /白细胞介素4毫升新鲜培养基中的淋巴细胞,在1.25 × 10 6细胞/ mL,生长因子,100微米,β-巯基乙醇和0.63微克/毫升,环孢素A,以防止T细胞的生长(由于浓度是指一毫升培养液!)。
  5. 取出从6孔板与tmuCD40L HeLa细胞预孵育中的上清。
  6. 轻轻地添加4毫升的淋巴细胞悬液(1.25 × 10 6细胞/ mL)以及每6孔板。
  7. 板在37℃,5%的CO 2。 第3天reculture细胞(二.1继续)。

二。 mCD40B细胞传代培养的(第3天,然后每周两次):

  1. 收获mCD40B大力移液10毫升到50毫升管的移液器和池他们向上和向下的细胞群。
  2. 离心7分钟在265 XG,并完全取代mCD40 - B的清洗介质的上清。虽然计数细胞数量的等分,旋转265 XG细胞为7分钟。 mCD40B悬浮细胞mCD40 - B的培养基中,在0.75 × 10 6细胞/ ml的浓度。
  3. 小鼠白细胞介素4的新鲜的解决方案中添加一个1 U /毫升,100μMβ-巯基乙醇和0.63μg/ mL的中期环孢素A的浓度。
  4. 取出从6孔板与照射tmuCD40L HeLa细胞预孵育中的上清。
  5. 轻轻地添加4毫升每6孔板以及mCD40B细胞悬液(0.75 × 10 6细胞/ mL)。
  6. 孵育板在37℃,5%的CO 2。
  7. 再次传代培养的细胞,每隔3-4天,以高纯度的小鼠CD40的B细胞激活后的14天总。

C.故障排除:CD40的B细胞,如果不长呢?

  1. 你有检查饲养层细胞的CD40的配体表达?
  2. 板约束馈线用于刺激超过24h以上的细胞?
  3. 是否有支原体污染吗?
  4. 是白细胞介素- 4解决方案,为补充新鲜解冻,并有相应的生物活性?
  5. 是β-巯基乙醇和环孢素A中添加正确的浓度?

图1
图1a。

图1 B
图1b。

图1 D
图1d。

图2
图2。

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Discussion

本协议的修改是可能的,尤其是关于CD40的刺激和使用的小鼠品系类型的起源,也高产高效代小鼠CD40激活的B细胞。艾哈迈迪等人。表明小鼠CD40的配体转染小鼠成纤维细胞类似的结果。可以肯定地排除在这种异种抗原的背景下演示,但在体内的安全性和毒性的深入研究了在此设置使用人类转染的HeLa细胞的炎症或自身免疫反应的迹象。然而,最好的替代代表与激活和增殖活动在同一时间,这是我们的知识不是市售的可溶性小鼠CD40的配体。

该协议也适用于129S2/SvPas小鼠(H - 2B单体)的淋巴细胞,但还没有进一步的小鼠品系到目前为止评价。此外,调整细胞密度的差异,细胞因子的浓度,持续时间环孢素A治疗,细胞培养基和菜肴也可能导致CD40的小鼠的B细胞类似的增殖率,有效地激活。然而,密集的工作已经花费了优化这个系统,最大限度地激活和增殖率,在现行制度。

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Disclosures

实验是按照实验动物饲养的国家和欧洲的指引。在谈到德国的动物福利法,动物是由当局控制的定期的。

Acknowledgements

我们诚恳地感谢克莱门斯Wendtner博士提供tmuCD40配体HeLa细胞株。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A. Preparation of Media:
1. Feeder cell wild type medium
RPMI 1640
L-Glutamine, 300 μg/mL
FBS, 10%
HEPES, 10 mM
Gentamycin, 15 μg/mL
2. Feeder cell selection medium
RPMI 1640
L-Glutamine, 300 μg/mL
FBS, 10%
HEPES, 10 mM
Gentamycin, 15 μg/mL
Hygromycin B, 0.2 mg/mL
3. mCD40-B washing medium
D-MEM
L-Glutamine, 580 μg/mL
Glucose, 4.5 mg/mL
HEPES, 10 mM
Gentamycin, 15 μg/mL
4. mCD40-B culture medium
D-MEM
L-Glutamine, 580 μg/mL
Glucose, 4.5 mg/mL
HEPES, 10 mM
Gentamycin, 15 μg/mL
MEM, 0.1mM (1x)
FBS, 10%
B. Miscellaneous Reagents:
RPMI 1640 Invitrogen REF 21875
D-MEM Invitrogen REF 41965
Dulbecco’s PBS (10x) PAA Laboratories Cat No H15-011
Gencin® Delta Select Art No 7395800
FBS Lonza Inc. Cat No DE14-802C
HEPES Buffer PAA Laboratories Cat No S11-001
MEM NEAA Invitrogen REF 11140
Hygromycin B PAA Laboratories Cat No P02-015
Recombinant Murine Interleukin-4 Immunotools Cat No 12340045
Cyclosporin A Novartis AG Cat No NDC 0078-0109-01
Trypsin/EDTA (10x) Invitrogen REF 15400-054
C. Miscellaneous Supplies:
Sterile pipette tips Sarstedt Ltd
6-well plate Nalge Nunc international Cat No 140675
50mL conical tube BD Biosciences Cat No 352070
Tissue culture flask Sarstedt Ltd Cat No 83.1813.002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Comments

2 Comments

  1. Hi Tanja,

    Is there a possibility of getting astock of tmuCD40L HeLa from your group. Thanks, Abdel Hamad

    Reply
    Posted by: abdel h.
    June 24, 2010 - 4:47 PM
  2. Hi Abdel,

    you should ask Prof. Dr. Clemens Wendtner to get them. Here his email: clemens-martin.wendtner@uk-kŒln.de

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 25, 2010 - 5:37 AM

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