アカゲザルの細胞性免疫応答のマルチカラーフローサイトメトリー解析

Immunology and Infection

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Summary

我々は、合計だけでなく、アカゲザルのCD4 +とCD8 + T細胞、HIV /エイズワクチン研究のための理想的なモデルのメモリのサブセットの詳細な表現型と機能解析のための多色フローサイトメトリーの有用性を実証する。

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He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques. J. Vis. Exp. (38), e1743, doi:10.3791/1743 (2010).

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Abstract

アカゲザルのモデルは、ワクチンや治療薬の開発のためだけでなく、病態の理解に関して、現在HIV - AIDSのための最善の利用可能なモデルです

Protocol

1)細胞調製と抗原刺激、2)表面マーカーの染色、3)細胞内サイトカイン染色、4)フローサイトメトリー:合計だけでなく、T細胞のメモリーのサブセットの詳細な表現型および機能解析のための手続は、4つの部分に分けることができます。分析。

1。細胞調製と抗原刺激

  1. 両方たての分離だけでなく、凍結保存された末梢血単核細胞(PBMC)は、このプロトコルで使用されていました。 PBMCをFicoll -ハイパック(Histopaquen - 1077、Sigma - Aldrich社、セントルイス、MO)を用いて密度勾配沈降によるアカゲザルのヘパリンまたはクエン酸静脈血サンプルから単離された。 PBMCのアリコートを液体窒素で90%FCS、10%DMSO中で凍結保存した。
  2. 低温保存されたPBMCを使用する場合は、冷凍PBMCのバイアルを液体窒素から取り出し、そして急速に穏やかに混合し、37℃の水浴中で解凍、凍結培地を除去するRPMI - 1640(HyClone研究所、ローガン、ユタ州)で洗浄し、完全なメディアに再懸[CM、10%を含むRPMI - 1640サプリメント熱不活化FCS(HyClone研究所)、2mMのL -グルタミン(Sigma - Aldrich社)、100U/mlペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen社)、および6で培養 - ウェル組織培養プレート37℃で一晩加湿5%CO 2雰囲気でC。翌朝は、生存細胞数をトリパンブルーの色素排除法により決定し、CMに再懸濁した。
  3. 細胞は、サイトカインの分析に続いて抗原特異的刺激に対する非特異的なために異なる方法で処理した:(a)ホルボール12 - ミリステート13 - アセテート(PMA)とイオノマイシン(I)(シグマ - アルドリッチ、セントルイスとの非特異的刺激に対してルイ、MO)、0.1ミリリットルの量で細胞のアリコート(1.0 × 10 6細胞/ウェル)を96ウェル組織培養プレート(BD Biosciences社、フランクリン湖、ニュージャージー州)の個々のウェルに播種した。 PMAとイオノマイシンは、それぞれ、50ng/mlおよび500ng/mlの最終濃度で使用されていました。 96ウェル組織培養プレートの最終的な総量は0.2ml/wellです:(b)の抗原特異的刺激の場合、容積1.0mlに1.0 × 10 6細胞を24ウェル組織培養プレート(BD Biosciences社の個々のウェルに播種した、井戸が以前に変更9で説明したように前処理したフランクリン湖、NJ)、。簡単に言えば、24ウェル組織培養プレートは4の50mmのTris溶液で2.5μg/ mlの/ウェルのヤギ抗マウスIgG(H + L)(キルケゴールとペリー研究所、ゲイサーズバーグ、MD)(PH 8.6)で被覆した° C一晩。プレートは滅菌PBSと共刺激抗体CD49dは、クローン9F10(BD Biosciences社、サンノゼ、カリフォルニア州)で2回洗浄した翌朝は、37℃で一時間インキュベートすることにより、10μg/ mlの時に追加/よく続いていた℃でインキュベーション後、プレートを室温で滅菌PBSで2回洗浄した。 six HIVエンベロープペプチド8のカクテルを含む、対象の抗原は、(各ペプチドの10μg/mlの最終濃度で添加した。単独でCMのセルを持つ追加の井戸をネガティブコントロールとして調製した。24各ウェルの最終的な合計容積ウェル組織培養プレートは1.0 mlであった。
  4. 細胞は37℃、加湿5%CO 2雰囲気で、Cで6時間培養した。ブレフェルジンAは、(シグマアルドリッチ、セントルイス、MO)刺激の最終的な4.5時間のために10μg/mlで培地に添加した。その後、細胞を5 mlのポリプロピレンチューブに移し、冷たい(4℃)フローの洗浄緩衝液(ダルベッコPBS(DPBS、 カルシウム /マグネシウム2 -無料で洗浄し、2%熱不活性化と生活の技術を、ロックビル、MD)その後FCS)、および様々な蛍光標識抗体で染色するために処理。

2。染色免疫蛍光表面マーカー

  1. 刺激された細胞は、最初の4で1UL LIVE / DEAD修正可能なアクア蛍光反応性色素で染色した℃で30分間、暗所でC、コールドフローの洗浄緩衝液で1回洗浄。
  2. その後、次のように適切に滴定する蛍光標識モノクローナル抗体を細胞に添加した:抗CD3 PE - Cy7(SP34 - 2)、抗CD8 Alexa700(RPA - T8)、抗CD28 PerCP - cy5.5(L293) 、抗CD95 APC(DX2)と抗CD4パシフィックブルー(OKT4)、(サンディエゴ、カリフォルニア州)eBioscience社からCD4除くBD Biosciences社(フランクリン湖、NJ)からすべて、パシフィックブルー(OKT4)。細胞は暗所で4℃で30分間℃でインキュベートした。
  3. 各実験のために報酬のコントロールと蛍光マイナス1(FMO)の両方は、10,11が利用されて制御します。補償のコントロールは、他の検出器に汚れ、個々の波及coeffecientsを決定するために利用された。補償制御の場合は、サルのいずれかから細胞懸濁液を含むチューブの完全なセットが個別に単一の色の染みのような蛍光コンジュゲート抗体で染色した。 FMOは、すべての試薬が関心のいずれかを含む多色染色の組み合わせであり、正の間の境界を決定するために使用されます自家蛍光レベルと完全に染色されたサンプル中に存在するデータを複製することで、ND負の人口。
  4. 染色した細胞はその後、コールドフロー洗浄バッファーで洗浄し、固定/膜浸透溶液(BD Biosciences社、サンノゼ、カリフォルニア州)で修正された(この段階で細胞を4℃で一晩保存することができます° Cを暗所で)少なくとも10分間細胞内サイトカイン染色を行う前に。

3。細胞内サイトカインの染色

  1. 固定された細胞はフローの洗浄緩衝液で洗浄し、その後、紹介予定/(BD Biosciences社、サンノゼ、カリフォルニア州)洗浄バッファーを製造者の指示に従って追加されました。簡単に言えば、細胞は4℃で10分間1Xパーマ/ Wash Bufferを0.1ミリリットルでインキュベートした。·ダークのC。
  2. その後、細胞を4℃で60分間、適切に滴定し、FITC標識抗IFN -γ(B27)と抗IL - 2、PE標識(MQ1 - 17H12)とともにインキュベートした。·ダークのC。
  3. その後、細胞は細胞膜透過液でさらに2回洗浄し、
  4. 最終洗浄後、細胞をDPBSで1%パラホルムアルデヒドで再懸濁し、24時間以内にフローサイトメトリー分析にかけた。

4。フローサイトメトリー分析

  1. またはシアンADP(Dako社、カーピンテリア、カリフォルニア州)、染色した細胞はLSR IIフローサイトメーター(サンノゼ、カリフォルニア州BD Biosciences社)に買収された。 FACSデータがFlowJoソフトウェア(木スター、オレゴン州アッシュランド)を用いて分析した。
  2. 図。 1は、代表的な動物とは異なるT細胞サブセットの解析に利用さゲーティングスキームを示しています。リンパ球は前方散乱光(FSC)対側方散乱(SSC)を介して第ゲートであり、その後のライブリンパ球は、SSCとアクア陰性人口に基づいて同定された。 T細胞はCD3 CD4の検出+ CD8 -(CD4 + T細胞)に続く発現とCD4 - CD8 +(CD8 + T細胞)によってその後CD3 + T細胞集団内の個体積極的に同定された。 CD4 +およびCD8 + T細胞は、さらにナイーブ(Tnは、CD28 + CD95 -)、中央のメモリ(TCM、CD28 + CD95 +)とエフェクターメモリー(TEM、CD28 - CD95 +)細胞と同様にCD28とCD95の発現に基づいて異なるサブセットに区別された文献5、10で説明しています。
  3. 図。 CD4 +およびCD8 + T細胞の異なるサブセットがPMAとイオノマイシン(PMA + I)による刺激に応答サイトカイン産生の点で機能的能力(INF -γおよび/またはIL - 2)について評価されたかを図2に示す。

5。代表的なFACSデータ

アカゲザルのPBMC組成物は、FACS分析を用いて決定した。図1は、代表的な動物とは異なるT細胞サブセットの解析に利用さゲーティングスキームを示しています。リンパ球は前方散乱光(FSC)対側方散乱(SSC)を介して第ゲートであり、その後のライブリンパ球は、SSCとアクア陰性人口に基づいて同定された。 T細胞は、その後、CD3の発現により同定した。 CD4 + CD8 -(CD4 + T細胞)とCD4 - CD8 +(CD8 + T細胞)はCD3 + T細胞集団内の個体数も測定した。図2に示すように、CD4 +およびCD8 + T細胞は、さらにナイーブ(Tnは、CD28 + CD95 -)、中央のメモリ(TCM、CD28 + CD95 +)とエフェクターメモリー(TEM、などのCD28とCD95の発現に基づいて異なるサブセットに区別されたCD28 - CD95 +)細胞。図2Aは、INF -γを示し、非刺激およびPMA /イオノマイシン刺激CD4 + T細胞、およびサブセット、および図2Bにおいて、IL - 2産生は、INF -γおよび非刺激およびPMA /イオノマイシンはCD8を刺激+ T細胞におけるIL - 2産生を示し、およびサブセット異なるサイトカインプロファイルは、各サブセットの刺激によって誘発さに注意してください。

図1
アカゲザルmacqauesのPBMC成分のフローサイトメトリー解析に使用する図1。ゲーティング戦略。してくださいここをクリックして図1の拡大バージョンを参照すること。

図2a
図2b
図2。 (A)総CD4 + T細胞とサブセット。のサイトカイン産生プロファイル合計CD8 + T細胞とサブセットの(B)サイトカイン産生プロファイル。してくださいここをクリックして大きな2aのバージョン、見てここにまたはを図2bの大きいバージョンのために。

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Acknowledgements

マカク血とPBMCサンプルの博士PramodさんNehete夫妻バーティNehete、この作業は、部分的にNIHの助成金AI 46969からの資金によって支えられて、そしてすべての細胞培養培地は、中央メディア研究所で生産され、NIHの助成CAによって資金を供給され16672。

Materials

Solution and Buffers

  • Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
  • RPMI-1640 medium (HyClone laboratories, Logan, UT)
  • Fetal Bovine Serum (FBS), (HyClone laboratories, Logan, UT)
  • L-glutamine (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
  • Penicillin/streptomycin (Invitrogen; Carlsbad, CA)
  • Trypan blue reagent (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
  • 50 mM Tris, PH 8.6; filtered and store at 4 °C
  • Dulbecco's PBS (DPBS, Ca2/Mg2-free; Life technologies, Rockville, MD)
  • Flow wash buffer: DPBS supplement with 2% FBS, store at 4 °C
  • BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Biosciences; San Jose, CA)

Activation agents

  • Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
  • Ionomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
  • Costimulatory mAb CD49d, clone 9F10 (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • Affinity purified antibody F (ab )2 fragments of Goat Anti-Mouse IgG (H + L) (Kierkegaard and Perry Laboratory, Gaithersburg, MD)
  • Specific activation agents could include peptide pools, single peptide, or whole protein

Cytokine secretion inhibitors

  • Brefedin A (BFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
  • Golgi Plug can be used alternatively (BD Biosciences; San Jose, CA)

Antibodies

  • Live/dead fixable aqua fluorescent stain kit (Invitrogen; Carlsbad, CA)
  • CD3 PE-Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • CD4 pacific blue (OKT4), (eBiosciences (San Diego, CA)
  • CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • CD28 PerCP-cy5.5 (L293), (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • CD95 APC (DX2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • IFN- FITC (B27), (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • IL-2 PE (MQ1-17H12), (BD Biosciences; San Jose, CA)

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References

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Comments

1 Comment

  1. Nothing novel. same old stuff

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 31, 2010 - 11:32 AM

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