ヒト臍帯静脈内皮細胞の単離(HUVEC)

Biology

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Summary

このビデオプロトコルは、ヒト臍帯からヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の単離と文化を示しています。一旦単離さこれらの細胞はまた、ヒューズの研究室で実証最適化されたフィブリンゲルビーズアッセイなどのin vitroでの血管新生アッセイに使用することができます。

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Davis, J., Crampton, S. P., Hughes, C. C. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC). J. Vis. Exp. (3), e183, doi:10.3791/183 (2007).

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Abstract

血管新生は血管新生の刺激に応答して、新しい血管が既存の血管系から作成される複雑なマルチステップのプロセスです。これらの手順は、次のとおりコード、管腔形成、吻合、および新たな基底膜の形成に細胞外マトリックス、ECの整列への内皮細胞の基底膜、増殖と移動(萌芽)(EC)の低下。 in vitroアッセイの多くは、このプロセスを研究するために開発が、ほとんど唯一の血管新生の特定の段階を模倣し、形態学的に血管が多くの場合、in vivoで血管似ていないされています。ここでは、ヒト臍帯静脈ECと線維芽細胞を利用したin vitroでの血管新生アッセイに最適化を示しています。このモデルは、反復する血管新生の重要な初期段階のすべてを、そして重要な血管が偏ECに囲まれた特許細胞間ルーメンを表示します。血管は容易に位相コントラストとタイムラプス顕微鏡で観察し、下流のアプリケーション用に純粋な形で回収することができます。

Protocol

手順

  1. 過剰な血液オフクリーンパッドとDABにコードを置く。コー​​ドの両端で新鮮なカットを行います。
  2. 静脈に、ONプラスチック針のシースで21 1 / 2 Gの針を挿入します 。 (静脈の最大の開口部である、2小さいものが動脈です。)
  3. 止血剤で固定針をクランプし、針にハンクスの20ccシリンジを取り付けます。
  4. 適度な圧力で静脈を通してハンクスを押してください 。漂白剤とビーカー内で廃棄物を収集する。 (押しながら片手で針とコードを保持する静脈から飛び出る針を妨げる。)静脈内の血液の多くがある場合は、もう一度洗う。
  5. パッドの上にコードを置くと静脈のもう一方の端をクランプ。脊髄に沿ってリークをチェックするハンクスの数mLで埋める。 5 mLを撤回し、底部のクランプを外してください。
  6. 20ccシリンジを外します。 10ccのシリンジからプランジャーを外します。 10mlのコラゲナーゼを投入し、プランジャーを交換、針に10ccの注射器を取り付けます。あなたが開放端を終了する最初の量が表示されるまで、静脈内にコラゲナーゼを押し込みます。開放端を再度クランプし、 静脈の中程度の膨満があるまでコラゲナーゼを詰めます。平滑筋の汚染でも多くの膨満結果。
  7. 軽くコードをマッサージ
  8. 37 DPBSでインキュベートするコード(接続されている止血、注射針や注射器付き)℃で15分間。
  9. インキュベートしながら、第2のコードと手順1-8を続ける。
  10. インキュベーション後、50mLのチューブを介して電源コードを保持しながらビーカーからコードを取り出しては、ボトムクランプ上記の端をカット。 チューブ内のすべてのものを収集してください 。コー​​ドを通して、残りのコラゲナーゼを押し、その後20ccシリンジを接続し、適度な圧力で通過ハンクスを押してください。
  11. は平滑筋細胞が必要とされていない場合、この時点でコードを破棄。それ以外の場合、37℃〜5ミリリットルコラゲナーゼとインキュベートで2 50mLのチューブに同じコードを配置° Cを30〜60分間。
  12. すべてのコードが終了するまでチューブを保管してください。
  13. 5分間〜1200 rpmでチューブを回転させる
  14. 上清を吸引しますが(1〜2 mLを除く)。T25で5mls PHECの+とプレートでペレットを再懸濁します
  15. ° Cで5%CO 2で一晩37℃でインキュベートする
  16. 翌日上清を除去し、新鮮な培地と交換してください。多くの赤血球がある場合は、M199で一度洗い、その後PHEC +を追加。プレートはコンフルエントになるまで(1-4日)いつものようにインキュベートし続ける。糊化T75に分割。
  17. 一度T75は3つのT75sに分割、合流です。フラスコごとに2つのバイアルを凍結する。

注:内皮細胞(不活性)石畳の外観を持っている。のカップルは、彼らが通常unactive状態に戻す通過した後に内皮細胞は時々 、右の分離後(長くて先のとがった)活性化される。

クリーン

  1. 非常に慎重に、鋭利物容器の中に針を処分する。
  2. ビッグバイオハザード容器に注射器を廃棄してください。
  3. 小さなバイオハザードバッグにすべての組織を置く。 -20閉じる袋と凍結°焼却時まで。
  4. 少なくとも10分間ヴァイラサイドゥですべての楽器を浸す。
  5. 廃棄物/漂白剤をビーカーにインキュベーションのメディアを追加します。少なくとも10分間放置します。
  6. バイオハザード廃棄物にベンチパッドを捨てる。
  7. ビーカー、ベンチトップとvircideで水浴の蓋の内側と外側を下にスプレーしてください。 10分を座らせて、その後拭いてください。
  8. 暖かい水でビーカーや楽器をすすぎ、(彼らが錆びていないので、楽器をオフブロット)乾燥してラックにハングアップする。
  9. シンク下除染廃棄物を処分。
  10. 冷蔵庫に未使用のメディアを返します。
  11. バイオハザード廃棄物の手袋を廃棄してください。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% Collagenase 10ml per cord, warmed to 37°C
Tissue culture flasks T75, one per cord.
Hanks medium
scissors sterile
beaker sterile
50 ml tubes

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Comments

10 Comments

  1. may you tell me wath kind of collagenase do you use? thank you!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 16, 2008 - 5:47 AM
  2. hi   i have been using dispase to isolate cells. iam succeeding in getting the cells but they are not spreading properly . even after two days iam not able to see  the typical cobble stone appearance. can you help.  Rathna  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 1, 2008 - 11:25 AM
  3. hallo,can you tell me what's the  PHEC+ ?thank you !

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 15, 2008 - 6:27 AM
  4. Hi, do you have any idea how many cells I can get from a 90% confluent flask (²5 or 75 qcm)? Many thanks in advance, Karin

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 26, 2009 - 8:06 AM
  5. From my experience working with HUVEC, a confluent T²5 flask has about 400,000 to 600,000 million cells while a confluent T75 flask has approximately ²-4 millions cells. From this, you can probably roughly deduce how many cells are in a 90% confluent T²5/T75 flask. I hope this help.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 8, 2009 - 5:45 AM
  6. hi
    how to i prepare collagenase for HUVEC isolation

    Reply
    Posted by: swati s.
    October 22, 2009 - 1:45 PM
  7. Hi,

    I was a synthetic organic chemist and am trying to conduct a bio-organic project. I will be very thankful if you would share some info with me about how to lysate the HUVECs.

    Ge

    Reply
    Posted by: Ge Z.
    January 11, 2010 - 6:56 PM
  8. To answer Ge's question, our lab lysate the HUVEC by adding lysate buffer 1x either in DPBS or water.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 20, 2010 - 2:54 PM
  9. Thank you so much for the answer. May I have more info regarding the components of your lysate buffer and at what condition do you lysate HUVECs?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 20, 2010 - 3:09 PM
  10. hi,

    Very Intresting way, but I wonder how many passages they can be usefull?
    Is there any difference between commercially available ones and freshly isolated ones(these ones)?
    Thanks in advance:-)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 3, 2012 - 11:57 AM

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