Isolering av mänskliga Endothelial Umbilical Vein Cells (HUVEC)

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denna video protokoll illustrerar isolering och odling av mänskliga endotelceller navelsträng ven celler (HUVEC) från människa navelsträngen. När isolerade dessa celler kan användas för in vitro-angiogenes-analyser som Optimerad Fibrin Gel Bead-analys också bevisas av Hughes labbet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Davis, J., Crampton, S. P., Hughes, C. C. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC). J. Vis. Exp. (3), e183, doi:10.3791/183 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Angiogenes är en komplicerad process i flera steg, där som svar på angiogena stimuli, nya fartyg skapas från den befintliga kärlbädden. Dessa åtgärder inkluderar: nedbrytning av basalmembranet, spridning och migration (spirande) av endotelceller (EG) i den extracellulära matrisen, anpassning av EG i sladdar, lumen bildning, anastomos och bildandet av en ny basalmembranet. Många in vitro-tester har utvecklats för att studera denna process, men de flesta bara härma vissa skeden av angiogenes, och morfologiskt fartygen ofta inte liknar fartygen in vivo. Här visar vi ett optimerat in vitro-angiogenes test som använder mänskliga EG navelsträngen ven och fibroblaster. Denna modell rekapitulerar alla de viktigaste tidiga stadierna av angiogenes, och viktigast fartygen displayen patentet intercellulära lumen omgiven av polariserad EG. Fartyg kan lätt observeras av faskontrast och Time-lapse mikroskopi och som återvinns i ren form för tillämpningar i efterföljande led.

Protocol

Förfarande

  1. Lägg sladden på rena pad och badda bort överflödigt blod. Gör färska snitt i båda ändarna av sladden.
  2. Sätt in 21 1 / 2 G nål med plast nålskyddet på, in i venen. (Den ven är den största öppningen, med de 2 mindre är artärer)
  3. Spänn nålen på plats med en hemostat och fäst 20CC spruta av Hanks till nålen.
  4. Tryck Hanks genom venen med måttligt tryck. Samla avfallet i bägaren med blekmedel. (Håll nålen och rep med en hand samtidigt som du trycker skulle förhindra nålen poppar ut ur venen.) Om det finns en hel del blod i venen, tvätta en gång till.
  5. Lägg sladden på pad och klämma den andra änden av venen. Fyll på med några ml Hanks att kolla efter läckor längs sladden. Dra ut 5 ml och koppla ner klämman.
  6. Koppla bort 20CC sprutan. Ta bort kolven från 10cc spruta. Fäst 10cc spruta med nål, häll i 10 ml kollagenas och byt kolven. Tryck kollagenas i ven tills du ser den första beloppet avsluta den öppna änden. Re-clamp den öppna änden och fyll med kollagenas tills det är måttlig uttänjning av ven. För mycket dilatation resulterar i glatt muskulatur kontaminering.
  7. Massage sladden försiktigt.
  8. Inkubera sladd (med peanger, nål och spruta bifogas) i DPBS vid 37 ° C i 15 min.
  9. Medan inkuberar fortsätter steg 1-8 med 2: a sladd.
  10. Efter inkubation, ta sladden ur bägare och medan du håller sladden över 50mL röret skär slutet ovanför botten klämman. Var noga med att samla allt i röret. Tryck återstående kollagenas genom sladden, anslut sedan 20CC sprutan och tryck Hanks igenom med måttligt tryck.
  11. Om ingen glatta muskelceller behövs, kasta linan vid denna tid. Annat sätt, för samma kabel till en andra 50mL rör med ~ 5ml kollagenas och inkubera vid 37 ° C i 30-60 min.
  12. Håll röret tills alla sladdar är klar.
  13. Spin rör vid ~ 1200 rpm under 5 minuter.
  14. Sug ut supernatant (utom för ~ 1-2 ml). Återsuspendera pelleten i 5mls PHEC + och plattan i en T25.
  15. Inkubera vid 37 ° C med 5% CO 2 över en natt.
  16. Nästa dag bort supernatanten och ersätta med nya medier. Om det finns många röda blodkropparna, tvätta en gång med M199, lägg sedan till PHEC +. Fortsätt inkuberar som vanligt tills plattan är konfluenta (1-4 dagar). Delas upp i en gelatiniserad T75.
  17. När T75 är konfluenta, uppdelad i tre T75s. Freeze två flaskor per flaska.

Obs: endotelceller (inaktiverad) har en kullersten utseende. Endotelceller är ibland aktiveras (lång och spetsig) direkt efter isolering, efter ett par går de oftast tillbaka in i en unactive tillstånd.

Cleanup

  1. Mycket noga, kasta nålar i avfallsbehållare.
  2. Kasta sprutor i stora biologiskt behållare.
  3. Lägg alla vävnader i små biologiskt väska. Stäng påsen och frys vid -20 ° tills förbränning.
  4. Blötlägg alla instrument i virucide i minst 10 min.
  5. Lägg inkubation media avfall / bleka bägare. Låt sitta i minst 10 min.
  6. Kasta bänken kuddar i biologiskt avfall.
  7. Spraya ner insidan och utsidan av bägare, bänkskiva och vattenbad lock med vircide. Låt sitta 10 minuter och sedan torka.
  8. Skölj bägare och instrument med varmt vatten och hänga på rack för att torka (blot av instrumenten så att de inte rost).
  9. Kassera sanerat avfall i vasken.
  10. Tillbaka oanvända media till kylskåp.
  11. Kasta handskar i biologiskt avfall.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% Collagenase 10ml per cord, warmed to 37°C
Tissue culture flasks T75, one per cord.
Hanks medium
scissors sterile
beaker sterile
50 ml tubes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Comments

10 Comments

  1. may you tell me wath kind of collagenase do you use? thank you!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 16, 2008 - 5:47 AM
  2. hi   i have been using dispase to isolate cells. iam succeeding in getting the cells but they are not spreading properly . even after two days iam not able to see  the typical cobble stone appearance. can you help.  Rathna  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 1, 2008 - 11:25 AM
  3. hallo,can you tell me what's the  PHEC+ ?thank you !

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 15, 2008 - 6:27 AM
  4. Hi, do you have any idea how many cells I can get from a 90% confluent flask (²5 or 75 qcm)? Many thanks in advance, Karin

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 26, 2009 - 8:06 AM
  5. From my experience working with HUVEC, a confluent T²5 flask has about 400,000 to 600,000 million cells while a confluent T75 flask has approximately ²-4 millions cells. From this, you can probably roughly deduce how many cells are in a 90% confluent T²5/T75 flask. I hope this help.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 8, 2009 - 5:45 AM
  6. hi
    how to i prepare collagenase for HUVEC isolation

    Reply
    Posted by: swati s.
    October 22, 2009 - 1:45 PM
  7. Hi,

    I was a synthetic organic chemist and am trying to conduct a bio-organic project. I will be very thankful if you would share some info with me about how to lysate the HUVECs.

    Ge

    Reply
    Posted by: Ge Z.
    January 11, 2010 - 6:56 PM
  8. To answer Ge's question, our lab lysate the HUVEC by adding lysate buffer 1x either in DPBS or water.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 20, 2010 - 2:54 PM
  9. Thank you so much for the answer. May I have more info regarding the components of your lysate buffer and at what condition do you lysate HUVECs?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 20, 2010 - 3:09 PM
  10. hi,

    Very Intresting way, but I wonder how many passages they can be usefull?
    Is there any difference between commercially available ones and freshly isolated ones(these ones)?
    Thanks in advance:-)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 3, 2012 - 11:57 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics