Lo sperma raccolto e l'inseminazione artificiale di topi

Biology

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Summary

Questo protocollo vengono utilizzati dei metodi per l'estrazione degli spermatozoi dai testicoli dei maschi e poi inseminazione topi femmina. Questa procedura è utile quando il tempo preciso è necessaria in studi sullo sviluppo e il lavoro transgenici.

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Duselis, A. R., Vrana, P. B. Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice. J. Vis. Exp. (3), e184, doi:10.3791/184 (2007).

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Abstract

Roditori del genere Peromyscus (topi cervi) sono i mammiferi autoctoni più diffusi del Nord America. Specie Peromyscus sono utilizzati in una vasta gamma di ricerca tra cui tossicologia, epidemiologia, ecologia, comportamento, e gli studi genetici. Qui essi forniscono un utile modello per le dimostrazioni di inseminazione artificiale.

Metodi simili a quelli visualizzati qui sono già state utilizzate in diversi studi topo cervo, ancora nessun protocollo dettagliato è stato pubblicato. Qui mostriamo il metodo di base della fecondazione artificiale. Questo metodo comporta l'estrazione dei testicoli dal roditore, poi isolare gli spermatozoi dall'epididimo e vasi deferenti. Lo sperma maturo, ora in una miscela di latte, sono collocati nel tratto riproduttivo della femmina al momento della ovulazione. Fecondazione viene considerato come 0 giorni per tempi di sviluppo embrionale. Gli embrioni possono poi essere recuperate al momento desiderato-point e manipolata.

L'inseminazione artificiale può essere utilizzato in una varietà di specie di roditori in cui tempistica esatta embrione è fondamentale o difficile da ottenere. Questa tecnica è di vitale importanza per le specie o ceppi (tra cui la maggior Peromyscus) che non possono accoppiarsi immediatamente e / o dove l'accoppiamento è difficile da valutare. Inoltre, l'inseminazione artificiale provvede esatta tempistica per lo sviluppo embrionale sia in corso la mappatura dello sviluppo e / o di lavoro transgenici. Riduzione del numero di animali possono essere utilizzati in quanto la fecondazione è garantita. Questo metodo è stato fondamentale per promuovere il sistema Peromyscus, e si spera beneficiare gli altri.

Protocol

Inseminazione artificiale

L'inseminazione artificiale è usato al posto di accoppiamenti naturali per aumentare le probabilità che tutte le femmine hanno avrà una gravidanza. 2 maschi è stato utilizzato per ogni 1 femmine superovulated o una femmina noti per essere in estro. L'epididimo caudae da maturare topi maschi sono stati collocati in una sospensione di latte 9% e affettato aperto con 18 aghi di calibro. Lo sperma è stato permesso di nuotare liberamente per qualche minuto e poi il epididimi sono state prese dalla miscela. La sospensione è stata valutata con un microscopio per la confluenza e di spermatozoi mobili. Un brusco AWG 22 ago 1 ½ pollice di lunghezza è stato utilizzato per amministrare lo sperma. A 120 piegare ° era collocato circa 3 / 4 ° verso il basso l'ago. L'ago è stato inserito nella vagina fino alla curva e 0,025 - 0.05mls iniettato. Se un assistente è utilizzato per contenere la femmina nella posizione appropriata, l'uso di anestetici non è necessario.

Preparazione

  1. Utilizzare 4 maschi per 6 femmine
  2. Euthanize maschi al vivaio
  3. Preparare circa 5 ml di latte 9% di latte in polvere
  4. Mettere 1,5 ml in piccole piastre di Petri
  5. Tagliare dell'Epididymus e vasi deferenti
  6. Metti in 1,5 ml del 9% latte
  7. Usando due aghi calibro 18, e con lunghi movimenti di taglio con aghi, fetta aperto dell'Epididymus e deferenti per rilasciare gli spermatozoi
  8. Estrarre rimasto tessuti e verificare la presenza di spermatozoi al microscopio

Iniezione

  1. Utilizzare l'ago smussato a 120 ° angolo
  2. Tenete il mouse in mano e iniettare miscela. Se a disagio con una persona in possesso e l'iniezione, due persone possono essere utilizzati. Nessun anestetico dovrebbe essere utilizzato, come si sa su come questo potrebbe influenzare la procedura.
  3. Utilizzare 0,05 ml di sperma / latte mix per femmina

Destinatario femmine

  1. Fare striscio vaginale sulle femmine destinatario (in questo periodo le femmine destinatario deve essere in proestro / estro)
  2. Femmine che non hanno raggiunto estro da 5 ° giorno non dovrebbe probabilmente utilizzato

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Acknowledgements

Vorrei ringraziare Mike Dewey dal Centro Peromyscus patrimonio genetico per le sue informazioni preziose, la pazienza e la conoscenza sulla riproduzione dei roditori.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Petri Dish Tool Fisher Scientific 08-772-30
18 gauge needle Tool BD Biosciences 305195
Powdered milk Reagent Any Supplier
1 ml syringe Tool National Scientific Company S7510-1
Forceps Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5060
Scissors Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5882
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Reagent GIBCO, by Life Technologies 14200-075
22 gauge blunt needle Tool Give to me

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Comments

15 Comments

  1. can you tell me the resolution power of the microscope at which you have shown the video and the make of the mcroscope used.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 17, 2007 - 12:56 AM
  2. The total magnification to do the AI is between 10-²0x depending on the user for basic dissection. The sperm can be seen at 400x

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 1, 2007 - 2:09 PM
  3. Hello Amanda!  Thank for this article. I d like if you can give me more information about the powered milk, and if there is any posibility of create "make in home" powered milk. Too , if you can please give me the aprox. milimeters that need introduce the nedlle into the vagina. You understand my english? Thank you. Carolina (from Buenos Aires, Argentina)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 29, 2008 - 9:09 AM
  4. Hi Carolina, The milk is a commercial powdered milk bought from a regular grocery store. I am not sure what it contains if you wanted to make it at home. A little less than 1 cm of the needle was inserted into the vagina for sperm delivery but if you want to test it...I would use a dead mouse to check the insertion length when making a new needle. Good luck Amanda  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2008 - 12:19 PM
  5. Would there be any difference in the dimention of the insemination needle for rats. Is there a non-invasive method of extracting sperm in rats. How can the vaginal smear indicate prŒstrus/estrus.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 26, 2008 - 2:28 AM
  6. I know it is been a while since you posted the video. But what is the success rate of this protocol? thanks Ming

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 11, 2008 - 11:45 AM
  7. Amanda, Our lab is just beginning to look into artificial insemination.  After watching your video and looking at a few other artificial insemination protocols, I have a couple of questions: (1) How to you assess or induce ovulation? (²) How do you induce pseudopregnancy? Thank you, Rob

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 2, 2009 - 6:02 PM
  8. Hola, respuesta para Robert Stiles, mira si tu problema es matar a los machos, lo que puedes hacer castrar a los animales, de esa manera no es necesario sacrificarlos. Por lo tanto puedes obtener los espermas necesarios sin sacrificar al animal.   Saludos desde México Roberto Lazzarini, Biologo experimental    

    Reply
    Posted by: Roberto L.
    January 29, 2009 - 8:45 PM
  9. Hy Amanda, I would like to know  some things: 1 - what is your success rate? ² - Do you use the vaginal tampon like described by LECKIE et al, 1973 (Biology of Reproduction, Vol 9, 4²0-4²5)? 3 - I tested the techinique using dye solution and, afterwards, I sacrified the female, but I didn't see any solution inside the uterus. Do you introduce the needle in the cervix (like in human intra-uterine insemination) or you just put the needle very closely to it. Because don't have how to have sure about introducing into the cervix, unless using a special speculus. Thank you Daniela  

    Reply
    Posted by: Daniela F.
    March 4, 2009 - 9:44 AM
  10. Please send me the full video of collection of sperm from mice. Because i could not able to see the full video content in my institution so send full video to my mail. thanking you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 18, 2009 - 1:18 AM
  11. Hi, please contact us at support@jove.com and we'll see what we can do.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 18, 2009 - 3:19 PM
  12. hi Amanda ,please Iwant a copy of the video and any related subjects if you can support them to me I will very gratful .
    with my regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 9, 2009 - 9:16 AM
  13. do you induce pseudopregnancy in the recipient female or do
    you literally just inject the donor sperm??
    If you induce how do you do this?
    What are the pregnancy rates like from using this AI?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 29, 2010 - 4:50 AM
  14. Hi dear Amanda, I want to collect semen from rat, but when I removed the seminal vesicles and I cut them, semen was coagulated immediately. . In fact I need a protocole for rat semen collection. Thanks for help.
    Ameneh immunology MS student

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2011 - 8:52 AM
  15. Good day maam! Can i ask the procedure how to extract the sperm form the cauda epididymis? thank you.

    Reply
    Posted by: jamee d.
    November 23, 2012 - 6:55 AM

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