Los espermatozoides de cosecha y la inseminación artificial de los ratones

Biology

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Summary

Este protocolo muestra los métodos para la extracción de los espermatozoides desde los testículos de los machos y luego inseminar a las hembras. Este procedimiento es útil cuando el tiempo exacto que se necesita en los estudios de desarrollo, así como el trabajo transgénico.

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Duselis, A. R., Vrana, P. B. Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice. J. Vis. Exp. (3), e184, doi:10.3791/184 (2007).

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Abstract

Los roedores del género Peromyscus (ratón venado) son los mamíferos nativos más prevalente en América del Norte. Peromyscus especies se utilizan en una amplia gama de investigación, incluyendo la toxicología, la epidemiología, la ecología, comportamiento, y los estudios genéticos. Aquí un modelo útil para las manifestaciones de la inseminación artificial.

Métodos similares a los que se muestran aquí se han utilizado previamente en varios estudios el ratón venado, todavía no existe un protocolo detallado se ha publicado. Aquí se demuestra el método básico de la inseminación artificial. Este método consiste en la extracción de los testículos de los roedores, y luego aislar los espermatozoides del epidídimo y conducto deferente. El esperma maduro, ahora en una mezcla de leche, se colocan en el tracto reproductivo de la hembra en el momento de la ovulación. La fertilización se cuenta como el día 0 para el tiempo de desarrollo del embrión. Los embriones se pueden recuperar en el tiempo deseado de puntos y manipulado.

La inseminación artificial se puede utilizar en una variedad de especies de roedores en el momento exacto de embriones es crucial y difícil de obtener. Esta técnica es de vital importancia para las especies o cepas (incluyendo la mayoría de Peromyscus) que no pueden aparearse inmediatamente y / o donde el apareamiento es difícil de evaluar. Además, la inseminación artificial proporciona tiempo exacto para el desarrollo del embrión ya sea en la cartografía de progreso en el desarrollo y / o trabajo transgénico. Reducción del número de animales se pueden utilizar desde la fecundación está garantizada. Este método ha sido vital para fomentar el sistema de Peromyscus, y se espera que se benefician los demás.

Protocol

Inseminación artificial

La inseminación artificial se utiliza en lugar de cruces naturales para aumentar las probabilidades de que todas las mujeres han de quedar embarazada. Dos hombres se utilizó para cada uno hembras superovuladas o una mujer sabe que está en celo. El epidídimo caudae de ratones machos maduros fueron colocados en una suspensión de leche 9% y el tajo con agujas de calibre 18. El esperma se les permite nadar libremente durante unos minutos y luego los epidídimos fueron tomadas de la mezcla. La suspensión se evaluó con un microscopio en busca de la confluencia y espermatozoides móviles. Un contundente calibre 22 de 1 ½ pulgadas de largo aguja se utiliza para administrar los espermatozoides. Una curva de 120 º se colocó cerca de 3 / 4 de la bajada de la aguja. La aguja se introduce en la vagina hasta la curva y 0.025 - 0.05mls inyectado. Si un asistente se utiliza para mantener a la hembra en la posición adecuada, el uso de anestesia no es necesaria.

Preparación

  1. Use cuatro hombres por 6 mujeres
  2. La eutanasia a los hombres en el vivero
  3. Prepare unos 5 ml de leche 9% de la leche en polvo
  4. Poner 1,5 ml en placa de Petri pequeña
  5. Cortar el epidídimo y conducto deferente
  6. Poner en 1,5 ml de leche 9%
  7. El uso de dos agujas de calibre 18, y el uso de movimiento de corte largo con agujas, corte abierta el epidídimo y conductos deferentes para liberar el esperma
  8. Sacar a la izquierda sobre el tejido y comprobar que los espermatozoides bajo microscopio

Inyección

  1. Uso aguja sin punta en ángulo de 120 °
  2. Mantenga el ratón en la mano y se inyecta la mezcla. Si siente incómodo con una persona que tiene y por vía intravenosa, dos personas pueden ser utilizados. Sin anestesia se debe utilizar, como en uno sabe cómo puede afectar el procedimiento.
  3. Utilice 0.05 ml de la mezcla de esperma / leche por hembra

Destinatario mujeres

  1. Hacer un frotis vaginal en hembras receptoras (en ese momento las hembras receptor debe estar en el proestro / estro)
  2. Las hembras que no han llegado a estro para el día 5 probablemente no debería utilizarse

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Acknowledgements

Me gustaría dar las gracias a Mike Dewey desde el Centro de archivo Peromyscus genética por su valiosa información, la paciencia y el conocimiento sobre la reproducción de roedores.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Petri Dish Tool Fisher Scientific 08-772-30
18 gauge needle Tool BD Biosciences 305195
Powdered milk Reagent Any Supplier
1 ml syringe Tool National Scientific Company S7510-1
Forceps Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5060
Scissors Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5882
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Reagent GIBCO, by Life Technologies 14200-075
22 gauge blunt needle Tool Give to me

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Comments

15 Comments

  1. can you tell me the resolution power of the microscope at which you have shown the video and the make of the mcroscope used.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 17, 2007 - 12:56 AM
  2. The total magnification to do the AI is between 10-²0x depending on the user for basic dissection. The sperm can be seen at 400x

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 1, 2007 - 2:09 PM
  3. Hello Amanda!  Thank for this article. I d like if you can give me more information about the powered milk, and if there is any posibility of create "make in home" powered milk. Too , if you can please give me the aprox. milimeters that need introduce the nedlle into the vagina. You understand my english? Thank you. Carolina (from Buenos Aires, Argentina)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 29, 2008 - 9:09 AM
  4. Hi Carolina, The milk is a commercial powdered milk bought from a regular grocery store. I am not sure what it contains if you wanted to make it at home. A little less than 1 cm of the needle was inserted into the vagina for sperm delivery but if you want to test it...I would use a dead mouse to check the insertion length when making a new needle. Good luck Amanda  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2008 - 12:19 PM
  5. Would there be any difference in the dimention of the insemination needle for rats. Is there a non-invasive method of extracting sperm in rats. How can the vaginal smear indicate prŒstrus/estrus.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 26, 2008 - 2:28 AM
  6. I know it is been a while since you posted the video. But what is the success rate of this protocol? thanks Ming

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 11, 2008 - 11:45 AM
  7. Amanda, Our lab is just beginning to look into artificial insemination.  After watching your video and looking at a few other artificial insemination protocols, I have a couple of questions: (1) How to you assess or induce ovulation? (²) How do you induce pseudopregnancy? Thank you, Rob

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 2, 2009 - 6:02 PM
  8. Hola, respuesta para Robert Stiles, mira si tu problema es matar a los machos, lo que puedes hacer castrar a los animales, de esa manera no es necesario sacrificarlos. Por lo tanto puedes obtener los espermas necesarios sin sacrificar al animal.   Saludos desde México Roberto Lazzarini, Biologo experimental    

    Reply
    Posted by: Roberto L.
    January 29, 2009 - 8:45 PM
  9. Hy Amanda, I would like to know  some things: 1 - what is your success rate? ² - Do you use the vaginal tampon like described by LECKIE et al, 1973 (Biology of Reproduction, Vol 9, 4²0-4²5)? 3 - I tested the techinique using dye solution and, afterwards, I sacrified the female, but I didn't see any solution inside the uterus. Do you introduce the needle in the cervix (like in human intra-uterine insemination) or you just put the needle very closely to it. Because don't have how to have sure about introducing into the cervix, unless using a special speculus. Thank you Daniela  

    Reply
    Posted by: Daniela F.
    March 4, 2009 - 9:44 AM
  10. Please send me the full video of collection of sperm from mice. Because i could not able to see the full video content in my institution so send full video to my mail. thanking you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 18, 2009 - 1:18 AM
  11. Hi, please contact us at support@jove.com and we'll see what we can do.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 18, 2009 - 3:19 PM
  12. hi Amanda ,please Iwant a copy of the video and any related subjects if you can support them to me I will very gratful .
    with my regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 9, 2009 - 9:16 AM
  13. do you induce pseudopregnancy in the recipient female or do
    you literally just inject the donor sperm??
    If you induce how do you do this?
    What are the pregnancy rates like from using this AI?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 29, 2010 - 4:50 AM
  14. Hi dear Amanda, I want to collect semen from rat, but when I removed the seminal vesicles and I cut them, semen was coagulated immediately. . In fact I need a protocole for rat semen collection. Thanks for help.
    Ameneh immunology MS student

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2011 - 8:52 AM
  15. Good day maam! Can i ask the procedure how to extract the sperm form the cauda epididymis? thank you.

    Reply
    Posted by: jamee d.
    November 23, 2012 - 6:55 AM

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