استرجاع البويضات ماوس

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هذا البروتوكول يوضح تقنية لاستخراج البويضات أو الأجنة في مرحلة مبكرة من قناة البيض المخصب من الفئران. القدرة على تحديد infindibulum وادخال ابرة في نهاية حادة من الضروري القيام بشكل صحيح الإجراء.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (3), e185, doi:10.3791/185 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

حتى الآن ، وأفادت دراسات قليلة فقط التلاعب الناجح للمرحلة التطور الجنيني Peromyscus أو البيولوجيا الإنجابية. جنبا إلى جنب مع الأسهم Peromyscus مركز الوراثية (http://stkctr.biol.sc.edu) ، ونحن تميز الاختلافات البارزة اللازمة لتطوير هذا النظام. وكان أحد الأهداف الرئيسية لتحسين البويضة / أوائل استرجاع الجنين.

Protocol

جنين / سيت استرجاعها

  1. يجب إذابة مدة ساعتين على الأقل قبل استرجاع الأجنة / البويضات ، يتم وضع KSOM في 37 درجة مئوية حاضنة 2 أكسيد الكربون وFHM من ° -20. ويستخدم الزجاج صحن يحتوي على ثلاثة آبار ضحلة مقعرة لقطرات منزل KSOM في الحاضنة. لمنع الجفاف ، وتوضع في طبق وKSOM حاوية بغطاء الماء الذي في الأسفل. هذا الجهاز يمنع التبخر من دون استخدام الزيوت المعدنية.

  2. توضع ناقلة البيضات من الإناث البيض في وسائل الإعلام FHM. لضمان التوجه infindibulum وسليمة ، ويتم قطع جزء صغير من المبيض مع قسم صغير من قناة البيض والرحم. يتم استخدام إبرة حادة قياس 30 لطرد الأجنة / البويضات من قناة البيض وذلك بإضافة إبرة حادة في infindibulum. يجب استخدام infindibulum لاسترداد الأجنة منذ أنابيب قناة البيض صغير جدا عن إبرة لتمرير. في حال تم إتلاف infindibulum ، يجب أن تكون قناة البيض شرائح إما فتح أو ضغط من الأجنة.

  3. تم العثور على الأجنة / البويضات في وسائل الإعلام من خلال التركيز FHM المجهر على قطرات الدهون التي غرقت في قاع الطبق بيتري. لا يمكن أن يتحقق جنين / البويضة في عزلة 20X لأن هذا يوفر مساحة أكبر من عرض التكبير عالية. جنين / البويضات تبدو وكأنها قطرات الدهون الجولة التي لها رنين واضحة حولها. يستخدم pipetting الفم ، وذلك باستخدام الزجاج وسحبت الشعرية ، لنقل الأجنة / البويضات لKSOM للحضانة والتلاعب أخرى.

الداخلي لاسترجاع سيت

إعداد

  1. ذوبان الجليد وإعداد FHM kSOM.
  2. وقبل ساعات قليلة ، kSOM مكان في حاوية استرجاع البيض ووضعه في خانة الطرف مع الماء في القاع ، في مكان CO 2 الحاضنة.
  3. تجلب أقفاص للمختبر وقتل الإناث الحصاد.
  4. قطع قناة البيض والحرص على خفض بعض من المبيض والرحم بعض لضمان أن لا قطع جزء من قناة البيض.
  5. المكان في وسائل الإعلام في طبق بتري FHM الصغيرة.
  6. صب أكثر زوجين FHM أطباق بتري وسائل الإعلام لاستخدامها في التنظيف.

بيغ

  1. استخدام إبرة بيغ (30 فظة قياس) متصلة مع نهاية الإبرة 1ml دوامة.
  2. تأخذ واحدة قناة البيض في وقت وباستخدام إبرة ، تضاف إلى قمع عثر عليها بالقرب من جزء من المبيض الأيسر المرفقة. إذا تم تدمير وقمع لا يمكن استخدامها ، ثم اثنين ملقط اتخاذ اجراء واحدة من نهاية قناة البيض. مع forcep أخرى ، الضغط بلطف ، مثل أنبوب معجون الأسنان ، لإخراج أي من الجنين.

    ملاحظة : هذا سيخلق كمية كبيرة من الطعام في صحن بيتري ، والكثير من الأنسجة سيأتي معه ، لذا قد تحتاج إلى استخدام طبق بتري مختلفة بعد ذلك.

  3. انظر إلى الأجنة ، والتركيز على قطع المجهر الدهون والبحث عن "قطعة من الدهون" دائرة مستديرة مع واضحة حولها.

    ملاحظة : قد تبدو الأجنة نفس الدهون ، لذلك قد يكون من الصعب العثور عليها. الأجنة تنزل الى القاع ، حتى ننظر هناك.

  4. لا المسحات المهبلية للإناث المتلقية. في هذه المرحلة ، ينبغي أن تكون pseudopregnant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه المقالة ، ونحن لشرح استرجاع البويضات من الاباضة بفعل Peromyscus (superovulated). استخدام فرط الإباضة (على العكس من دورة دقي الطبيعي) هو شائع نظرا لأعداد أكبر بكثير الناتجة عن ذلك. ومع ذلك ، يجب اتخاذ الحذر في تفسير نتائج استخدام هذه البويضات / الأجنة ، كما كل من الهرمونات المستخدمة للحث على التبويض وزراعة قد يكون لها آثار.

عندما تم تأكيد ودقي ، وeuthenized الإناث واستعادت ناقلة البيضات مع جزء صغير من المبيض. ويستخدم هذه المنطقة الصغيرة من المبيض كعلامة لموقع infindibulum. وinfindibulum يجلس بجوار المبيض ، في كثير من الأحيان من خلال إبراز طبقة رقيقة من الأنسجة. على الجانب الآخر من هذا النسيج ، وملفوف بقية قناة البيض ، ويفضي في نهاية المطاف إلى المهبل. فمن الأفضل لدفع السوائل من خلال infindibulum لاستخراج البويضات. هذا الاتجاه هو ضروري بسبب وجود صمام باتجاه واحد يقع في واجهة المهبل ، قناة البيض. قد تكون أضرت البويضات إذا من المتوقع لها الى الوراء من خلال الصمام.

يتم إدراج 30 gaugle إبرة حادة في نهاية infindibulum. سوف إبرة حادة نهاية تناسب افتتاح infindibulum ، لكنها لن تدخل في الأنبوب قناة البيض. لذا ، يجب توخي الحذر لضمان عدم تضرر infindibulum خلال تشريح أو استرجاع البويضة. في حالة تلف infindibulum ، يمكن ضغط الأنبوب عبر قناة البيض ملقط السماح لأي البويضات للخروج المحاصرين.

بافتراض أن الإناث كان في ودقي ، والأعضاء التناسلية وظهور الحمراء بسبب زيادة كميات الدم وتظهر منتفخة. لاحظنا الاختلافات في الأنواع الغزلان الماوس اثنين اختبار : P. polionotus كان المبيضين fattier بكثير وناقلة البيضات من maniculatus P. ، مما يجعل استرجاع البويضة أكثر صعوبة.

بمجرد أن تمت إزالة البويضات من قناة البيض ، قد لاحظوا بواسطة المجهر الضوئي في التكبير منخفضة. عرض البويضات في أقل التكبير تسمح للمستخدم لمسح طبق بيتري بسرعة. ينبغي أن تركز المجهر على الطبقة السفلية من حبيبات الدهون. سوف تبدو البويضات حبيبات الدهون الجولة تماما مع حلقة واضحة نحو الخارج. للمساعدة في الكشف عن البويضات ، حاول ضبط الضوء من خلال إبراز طبق بيتري. وبالإضافة إلى ذلك ، وليس البويضات إذا اهتزت طفيفة طبق بيتري التحرك مقارنة مع قطرات الدهون. قد تكون هذه التلميحات تساعد الباحث المبتدئ لتحديد البويضات ، ومع ذلك ، فمن المرجح أن عدة محاكمات ستكون ضرورية قبل واحد هو مريح لهذا الإجراء.

ويمكن استخدام البويضات معزولة في مجموعة متنوعة من التجارب بما في ذلك انتاج خلايا جذعية وإنتاج الوهم ، أو التلاعب الجيني. في حين أننا وجدنا تفاوتا كبيرا في المعلمات والتوقيت المطلوب للحث على الإباضة ، ينبغي أن التقنيات العامة لاسترجاعها أن تنطبق على العديد من أنواع القوارض (الفئران والغزلان ~ 30 مليون سنة تباينت من الفئران المختبرية على حد سواء والفئران). ونحن نأمل ولا سيما أن هذا سيفيد أولئك الذين يعملون في النظم الرواية حيث لا هذه التقنيات الراسخة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

وأود أن أشكر مايك ديوي من مركز ألبوم الوراثية Peromyscus على صبره والمساعدة والمعرفة.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Flushing needle Tool Zephyrtronics ZT5-130-L 30 gauge blunt
Forceps (2) Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5060
Peromyscus Animal Peromyscus Genetic Stock Center
Scissors Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5880
FHM HEPES Buffered Media Reagent Specialty Media MR-025-d
KSOM Embryo Culture Medium (5x10 ml) Reagent Specialty Media MR-020P-5F
Mouth Pipette Tool Pulled from glass capillaries and attached to rubber tubing
Oocyte holding dish Tool Glass container with concave divets

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Comments

3 Comments

  1. hi Amanda! i'm Anna from the Ken Cho lab here at UCI.  i'm starting work with mouse blastocysts (e3.5, e4.5), & i'm hoping you can give me advice on how to handle them?  i'm able to successfully Xgal stain blastocysts, but by the end of the procedure, then look "flattened" so i can't really discern where the Xgal staining is localized.  how do i maintain the round morphology?  and how do you fix your blastocysts?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 17, 2008 - 4:08 PM
  2. what is flushing needle?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 27, 2008 - 5:41 AM
  3. hi
    i request to view this video

    Reply
    Posted by: arun m.
    September 9, 2009 - 5:50 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics