마우스 Oocytes의 검색

Biology

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Summary

이 프로토콜은 생쥐의 수란관에서 추출 oocytes 또는 초기 단계 수정된 배아에 대한 기법을 보여줍니다. infindibulum를 식별하고 그것에 뭉툭한 끝을 바늘을 삽입하는 기능은 제대로 절차를 수행하는 것이 필수적입니다.

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Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (3), e185, doi:10.3791/185 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

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Abstract

지금까지 단 몇 연구 Peromyscus embryogenesis 또는 생식 생물학의 성공적인 조작을보고있다. 함께 Peromyscus 유전 증권 센터 (http://stkctr.biol.sc.edu)로, 우리는이 시스템을 개발하는 데 필요한 돌출 차이를 특성화하고 있습니다. 기본 목표는 oocyte / 초기 배아 검색을 최적화되었습니다.

Protocol

배아 / Oocyte 검색

  1. 이전 배아 / oocytes의 검색에 적어도 두 시간은, KSOM가 37 º C CO 2 배양기와 FHM에 배치됩니다는 -20 °에서 해동의해야합니다. 세 오목한 얕은 우물을 포함하는 유리 그릇은 인큐베이터에 KSOM의 집 방울하는 데 사용됩니다. 탈수 방지하기 위해, KSOM와 접시는 바닥에 물이있는 lidded 컨테이너에 배치됩니다. 이 장치는 광유를 사용하지 않고 증발을 방지합니다.

  2. 앤 여성에서 oviducts는 FHM 미디어에 배치됩니다. 오리 엔테이션 및 손상 infindibulum을 보장하기 위해, 난소의 작은 섹션은 자궁의 수란관 작은 섹션과 함께 절단됩니다. 뭉툭한 30 게이지 바늘이 infindibulum에 무딘 바늘을 삽입하여 수란관에서 배아 / oocytes을 추방하는 데 사용됩니다. 수란관 튜브 통과하기 위해 바늘에 비해 너무 작습니다 때문에 infindibulum는 배아를 검색하는 데 사용해야합니다. infindibulum이 파괴되는 경우, 수란관이 중 오픈 슬라이스 또는 배아 압박이 있어야합니다.

  3. 배아 / oocytes는 페트리 접시의 바닥으로 가라앉아있는 기름 방울에 현미경을 집중하여 FHM 미디어에서 찾을 수 있습니다. 이것은 높은 배율보다 큰 가시 영역을 제공하는 등 배아 / oocyte 격리는 20x에서 달성될 수있다. 배아 / oocytes는 주위 명확한 반지를 가지고있는 원형 지방 방울 같아. 모세관 뽑아 유리를 사용하여 입으로 pipetting은, 부화 및 추가 조작에 대한 KSOM에 배아 / oocytes를 이동하는 데 사용됩니다.

Oocyte 정보 검색을위한 절차

준비

  1. FHM를 해동하고 kSOM을 준비합니다.
  2. 몇 시간 전에, 아래의 물과 팁 상자, CO 2 배양기에서 장소에 달걀 검색 컨테이너와 장소에서 적절한 kSOM.
  3. 연구실에 새장을 지참하고 수확 여성을 죽일.
  4. 당신이 수란관의 일부를 잘라하지 않도록하기 위해 난소의 일부와 자궁의 일부를 잘라주의되는 수란관을 잘라 버릴거야.
  5. 작은 배양 접시에있는 FHM 미디어에 놓습니다.
  6. 플러싱에 사용되는 몇 가지 더 FHM 미디어 페트리 요리를 붓고.

홍조

  1. 나선형 엔드와 1ml 바늘에 연결된 플러싱 바늘 (30 게이지 퉁명스러운)를 사용합니다.
  2. 난소의 부분 첨부된 왼쪽 근처에서 발견 infundibulum에 삽입 시간과 바늘을 사용하여 하나의 수란관을 가져가라. infundibulum이 파괴되고 사용할 수 없다면, 그럼 두 포셉을 가지고 수란관의 한쪽 끝을 잡고. 다른 forcep으로 부드럽게 모든 배아의를 꺼내, 치약 튜브처럼, 짠다.

    참고 : 조직의 많은 그것 같이되므로이, 페트리 접시에 엉망이 다량을 생성하므로 나중에 다른 페트리 접시를 사용할 수 있습니다.

  3. , 배아를 참조 지방 조각에 현미경을 집중하고 주변 클리어 서클과 원형 "지방 조각 '을 찾기 위해.

    참고 : 배아는 지방과 같은 모양을 가지고 있으므로 그것이 찾기 힘들 수 있습니다. 태아가 아래로 침몰, 그래서 거기에 봐요.

  4. 받는 여성의 질 얼룩을 마십시오. 이 단계에서, 그들은 pseudopregnant해야합니다.

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Discussion

이 문서에서는, 우리는 배란 유도 (superovulated) Peromyscus에서 oocytes의 검색을 보여줍니다. superovulation의 사용은 (천연 estrous 사이클 반대) 때문에 훨씬 더 결과 숫자로 일반적입니다. 그러나,주의는 배란과 culturing를 유도하는 데 사용되는 호르몬이 모두 영향을 수 있으므로, 이러한 oocytes / 배아를 이용 결과를 해석에 촬영해야합니다.

estrous이 확정되면, 암컷은 euthenized와 oviducts는 난소의 일부와 함께 회복되었습니다. 난소의 작은 지역은 infindibulum의 위치를​​ 표지로 사용됩니다. infindibulum은 종종 시간은 조직의 얇은 계층을 통해 돌출, 난소 옆에 앉아있다. 이 조직의 다른 측면에서 수란관의 나머지 코일되고 결국 질로 연결됩니다. oocytes를 추출 infindibulum를 통해 유체를 밀어하는 것이 좋습니다. 이 방향으로 인해 질 - 수란관 인터페이스에있는 편도 밸브가 필요합니다. 그들은 밸브를 통해 거꾸로 예상하는 경우 oocytes가 다치게 수 있습니다.

30 gaugle 뭉툭한 끝 바늘은 infindibulum에 삽입됩니다. 뭉툭한 끝 바늘은 infindibulum 오픈 맞게되지만 수란관 튜브에 적합하지 않습니다. 따라서 infindibulum가 절개 또는 oocyte 복구 중에 손상되지 않도록주의 이동합니다. infindibulum가 손상된 경우에 갇힌 oocytes가 종료 수 있도록, 수란관 튜브는 집게로 압착 수 있습니다.

여성을 가졌다고 가정하면 estrous에, 생식기는 증가 혈액 공급으로 인해 붉은 외관을하고 부어 나타납니다. P. polionotus는 P. maniculatus보다 fattier 난소와 oviducts도 가지고 oocyte의 검색이 더 어렵게 만들기 : 우리는 두 사슴 마우스 종의 차이는 테스트를 관찰했다.

oocytes가 수란관에서 제거되면, 그들은 낮은 배율에서 가벼운 현미경에 의해 관찰 수 있습니다. 낮은 배율에서 oocytes를 보는 것은 사용자가 신속하게 페트리 접시를 검색하실 수 있습니다. 현미경은 지방 과립 하단의 레이어에 집중해야합니다. oocytes은 밖으로 명확한 반지 동그란 지방 과립처럼 보이게됩니다. oocytes를 감지에 도움하려면, 페트리 접시를 통해 돌출 빛을을 조정하십시오. 또한, 페트리 접시가 가볍게 떨면서 경우 ​​oocytes는 지방 방울에 비해 이동하지 않습니다. 이러한 힌트는 oocytes를 찾을 수 초보자 연구원 도움이 될 수 있지만, 그것은 하나 절차와 편안한되기 전에 여러 가지 시련이 필요합니다 가능성이 높습니다.

절연 oocytes는 줄기 세포 라인, chimeras 생산, 또는 유전자 조작의 생산을 포함하여 실험의 다양한 사용할 수 있습니다. 우리는 매개 변수와 배란을 유도하는 데 필요한 타이밍에 상당한 변화를 발견하지만, 검색에 대한 일반적인 기술은 많은 설치류 종 (사슴 마우스는 실험실 마우스 및 쥐 모두에서 갈라 ~ 30,000,000년 있습니다)에 해당되어야합니다. 우리는이 같은 기술이 잘 확립되지 않은 소설의 시스템에서 이러한 작업에 도움이됩니다 특히 희망하고 있습니다.

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Acknowledgements

나는 그의 도움 인내와 지식에 대한 Peromyscus 유전자 증권 센터에서 마이크 듀이 감사하고 싶습니다.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Flushing needle Tool Zephyrtronics ZT5-130-L 30 gauge blunt
Forceps (2) Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5060
Peromyscus Animal Peromyscus Genetic Stock Center
Scissors Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5880
FHM HEPES Buffered Media Reagent Specialty Media MR-025-d
KSOM Embryo Culture Medium (5x10 ml) Reagent Specialty Media MR-020P-5F
Mouth Pipette Tool Pulled from glass capillaries and attached to rubber tubing
Oocyte holding dish Tool Glass container with concave divets

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Comments

3 Comments

  1. hi Amanda! i'm Anna from the Ken Cho lab here at UCI.  i'm starting work with mouse blastocysts (e3.5, e4.5), & i'm hoping you can give me advice on how to handle them?  i'm able to successfully Xgal stain blastocysts, but by the end of the procedure, then look "flattened" so i can't really discern where the Xgal staining is localized.  how do i maintain the round morphology?  and how do you fix your blastocysts?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 17, 2008 - 4:08 PM
  2. what is flushing needle?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 27, 2008 - 5:41 AM
  3. hi
    i request to view this video

    Reply
    Posted by: arun m.
    September 9, 2009 - 5:50 AM

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