Hämtning av Mouse oocyter

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Detta protokoll illustrerar tekniken för utvinning av ägg eller tidiga befruktade embryon från äggledare hos möss. Förmågan att identifiera infindibulum och sätt in en trubbiga änden nål i är det viktigt att korrekt hela proceduren.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (3), e185, doi:10.3791/185 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hittills har endast ett fåtal studier som rapporterat framgångsrika manipulationer Peromyscus embryogenesen eller reproduktiva biologi. Tillsammans med Peromyscus Genetiska Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), vi är som kännetecknar de framträdande skillnader behövs för att utveckla detta system. Ett primärt mål har varit att optimera äggcellen / tidiga embryot hämtning.

Protocol

Embryot / Oocyte

  1. Minst två timmar före hämtning av embryon / ägg, är KSOM placeras i 37 º C CO 2 inkubator och FHM måste tinas från -20 °. En glasskål med tre konkav grunda brunnar används för att hysa droppar KSOM i inkubatorn. För att förhindra uttorkning, är KSOM och fat placeras i en lockförsedda behållare som har vatten i botten. Denna apparat förhindrar avdunstning utan användning av mineralolja.

  2. Den äggledarna från en ägglossning kvinnliga placeras i FHM medier. För att säkerställa orientering och en intakt infindibulum är en liten del av äggstocken skär tillsammans med äggledare och liten del av livmodern. Ett trubbigt 30 gauge nål används för att utvisa embryon / oocyter från äggledare genom att sätta in trubbiga nålen i infindibulum. Den infindibulum måste användas för att hämta embryon eftersom äggledare slangen är för liten för en nål att passera. I händelse av att infindibulum är förstört, måste äggledare vara antingen skivas öppen eller embryon trängs ut.

  3. Embryon / ägg finns i FHM medierna genom att fokusera mikroskop på fettet droppar som har sjunkit till botten av petriskål. Embryo / äggcell isolering kan uppnås vid 20x eftersom detta ger en större visningsyta än hög förstoring. Embryo / oocyter ser ut som runda fett droppar som har en tydlig ring runt den. Munpipettering, med hjälp av en drog glas kapillär, används för att flytta embryon / ägg till KSOM för inkubering och vidare manipulation.

Förfarande för Oocyte

Förberedelser

  1. Tina FHM och förbereda kSOM.
  2. Ett par timmar tidigare, placera kSOM i äggplockning behållare och lägg i spetsen låda med vatten i botten, placera i CO 2 inkubator.
  3. Ta burar till labbet och döda skörd honorna.
  4. Klipp ut äggledare var noga med att skära en del av äggstocken och en del av livmodern för att se till att du inte skära av en del av äggledare.
  5. Placera i FHM media i liten petriskål.
  6. Häll ett par mer FHM media petriskålar som ska användas för spolning.

Flushing

  1. Använd en spolning nål (30 gauge trubbig) ansluten till en 1 ml nål med spiral slut.
  2. Ta en äggledare i taget och med hjälp av nål, sätt in infundibulum hittades nära den del av äggstockarna lämnas kvar. Om infundibulum förstörs och inte kan användas, får ta två pincett och håll den ena änden av äggledare. Med andra forcep, kläm försiktigt, som en tandkrämstub, för att mata någon embryots.

    OBS: Detta kommer att skapa en stor mängd av röran i petriskål, som en del av vävnad kommer med den, så du kanske vill använda en annan petriskål efteråt.

  3. För att se embryon, fokus mikroskop på fett bitar och leta efter runda "fett pjäs" med tydlig cirkel runt den.

    Obs: embryon har samma utseende som fett, så det kan vara svårt att hitta. Embryona sjunker till botten, så titta där.

  4. Gör vaginala utstryk av mottagare honor. I detta skede bör de pseudopregnant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denna artikel visar vi att hämta ägg från ägglossning-inducerad (superovulated) Peromyscus. Användningen av superovulation (i motsats till naturliga estrous cykel) är vanlig på grund av den mycket större resulterande numren. Dock måste försiktighet iakttas vid tolkningen av resultaten använda sådana oocyter / embryon, eftersom både de hormoner som används för att framkalla ägglossning och odling kan ha effekter.

När estrous har bekräftats, är kvinnor euthenized och äggledarna återhämtade tillsammans med en liten del av äggstocken. Den lilla regionen äggstockarna används som en markör för placering infindibulum. Den infindibulum sitter bredvid äggstocken, ofta gånger skjuter genom ett tunt lager av vävnad. På andra sidan av denna vävnad, är resten av äggledare rullade och så småningom leder in i slidan. Det är bäst att pressa vätska genom infindibulum att extrahera oocyter. Denna riktning är nödvändigt på grund av en enkelriktad ventil placerad på slidan-äggledare gränssnitt. De oocyter kan skadas om de projiceras bakåt genom ventilen.

En 30-gaugle trubbiga änden nål sätts in i infindibulum. Den trubbiga änden Nålen kommer att passa infindibulum öppningen, men kommer inte passar in i äggledare slangen. Därför måste försiktighet iakttas för att säkerställa att infindibulum inte skadas under dissektion eller Oocyte. Om infindibulum är skadad, kan äggledare slangen pressas via pincett för att tillåta någon fångade ägg för att avsluta.

Förutsatt att honan var i estrous kommer reproduktionsorgan har en röd utseende på grund av ökad blodtillförsel och verkar svullet. Vi observerade skillnader i de två arter rådjur mus testade P. polionotus hade mycket fetare äggstockarna och äggledarna än P. maniculatus, vilket gör Oocyte svårare.

När ägg har avlägsnats från äggledare, kan de följas av ljusmikroskop vid låg förstoring. Visa oocyter till en lägre förstoringsgrad ger användaren möjlighet att skanna petriskål snabbt. Mikroskopet bör fokuseras på det nedersta lagret av fett granulat. De oocyter kommer att se ut helt rund fet granulat med en tydlig ring runt utsidan. Till hjälp att upptäcka de oocyter, försöka justera ljuset utstickande genom petriskål. Dessutom kommer om petriskålen är lätt skakas oocyter inte flytta jämfört med fett droppar. Dessa tips kan hjälpa nybörjare forskare att hitta ägg, dock är det troligt att flera försök kommer att krävas innan man är bekväm med förfarandet.

De isolerade oocyter kan användas i en mängd olika experiment inklusive framställning av stamcellslinjer, tillverkning av chimärer, eller genetiska manipulationer. Även om vi har hittat stora skillnader i de parametrar och den tidsplan som krävs för att inducera ovulation, bör den generella tekniker för hämtning tillämpas på många arter av gnagare (rådjur möss är ~ 30 miljoner år avvek från både laboratorie-möss och råttor). Vi är särskilt hoppfull om att detta kommer att gynna dem som arbetar i nya system där sådana metoder inte är väletablerade.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Jag vill tacka Mike Dewey från Peromyscus genetiska Stock Centrum för hans hjälp, tålamod och kunskap.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Flushing needle Tool Zephyrtronics ZT5-130-L 30 gauge blunt
Forceps (2) Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5060
Peromyscus Animal Peromyscus Genetic Stock Center
Scissors Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5880
FHM HEPES Buffered Media Reagent Specialty Media MR-025-d
KSOM Embryo Culture Medium (5x10 ml) Reagent Specialty Media MR-020P-5F
Mouth Pipette Tool Pulled from glass capillaries and attached to rubber tubing
Oocyte holding dish Tool Glass container with concave divets

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Comments

3 Comments

  1. hi Amanda! i'm Anna from the Ken Cho lab here at UCI.  i'm starting work with mouse blastocysts (e3.5, e4.5), & i'm hoping you can give me advice on how to handle them?  i'm able to successfully Xgal stain blastocysts, but by the end of the procedure, then look "flattened" so i can't really discern where the Xgal staining is localized.  how do i maintain the round morphology?  and how do you fix your blastocysts?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 17, 2008 - 4:08 PM
  2. what is flushing needle?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 27, 2008 - 5:41 AM
  3. hi
    i request to view this video

    Reply
    Posted by: arun m.
    September 9, 2009 - 5:50 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics