Um modelo de Disturbed Aterosclerose Flow-induzido em rato artéria carótida pela ligadura parcial e um método simples de isolamento de RNA a partir do endotélio Carótidas

Medicine

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Summary

Esta descreve uma cirurgia de ligadura parcial da carótida, o que causa as condições de fluxo perturbado e desenvolvimento da aterosclerose subsequente (em duas semanas) com intraplaca neo-vascularização (em quatro semanas) em ratos artéria carótida comum. Descrevemos também um novo método de isolamento de RNA a íntima carótida, proporcionando RNA de alta pureza endoteliais.

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Nam, D., Ni, C., Rezvan, A., Suo, J., Budzyn, K., Llanos, A., Harrison, D. G., Giddens, D. P., Jo, H. A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium. J. Vis. Exp. (40), e1861, doi:10.3791/1861 (2010).

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Abstract

Apesar da conhecida associação perto, evidências diretas ligando fluxo perturbado a aterogênese tem faltado. Recentemente, usou uma versão modificada do carótida métodos de ligadura parcial [1,2] para mostrar que induz agudamente condições de baixo fluxo e oscilatório, duas características-chave do fluxo perturbado, no rato artéria carótida comum. Usando esse modelo, nós fornecemos evidências diretas de que o fluxo perturbado realmente leva ao desenvolvimento de aterosclerose rápido e robusto em apolipoproteína rato knockout E [3]. Também desenvolveu um método de preparação de RNA endotelial com elevado grau de pureza da carótida íntima do mouse [3]. Usando este modelo de mouse e método, encontramos que a ligadura parcial causa disfunção endotelial em uma semana, seguido pela formação de ateromas robusta e rápida em duas semanas em um modelo de camundongo hiperlipidêmicos, juntamente com recursos de formação de lesão complexa como a neovascularização intraplaca por quatro semanas. Essa rápida

Protocol

1. Ligadura parcial da artéria carótida esquerda

  1. Mouses são utilizados em ~ 8 semanas de idade. O peso dos ratos é recomendado para ser pelo menos 18 gramas.
  2. Esterilizar os instrumentos para 30 segundo no esterilizador instrumento talão e deixe esfriar
  3. Induzir a anestesia com Ketamina (80mg/kg) e xilazina (10mg/kg) intraperitonial injeção (ip) ou alternativa anestesia aprovado pelo IACUC. Para injeção ip, injetar mouse no quadrante esquerdo baixo do abdômen.
  4. Colocar o mouse em uma câmara de aquecimento até que esteja completamente anestesiado. Verifique a profundidade da anestesia com resposta a pitada dedo do pé.
  5. Colocar o mouse em um estágio cirúrgico, em decúbito dorsal (barriga para cima lado) posição. Tape as patas fore-palmas para cima e na sola patas traseiras, até o palco.
  6. Aplique uma quantidade liberal de agente depilatório (por exemplo, Nair) no pescoço entre a mandíbula eo esterno. Massageie suavemente até que todo o cabelo é removido.
  7. Limpe o agente depilatórios e aplicar quantidade generosa de Betadine para a área depilada.
  8. Prepare uma polegada de comprimento seções de 6-0 seda para ligadura. Cada rato vai precisar de dois pedaços de sutura.
  9. Usando uma tesoura afiada pequena, faça uma incisão 4-6mm vertical no meio do pescoço. A pele e da fáscia subjacente precisam ser cortadas.
  10. Mover a parótida esquerda da linha média para a esquerda e começar a dissecar sem rodeios logo à direita da traquéia. Você deve ser capaz de identificar a carótida esquerda pulsante comum facilmente.
  11. Siga as carótida comum caudalmente até localizar a bifurcação.
  12. Sem rodeios dissecar a bifurcação para expor os seguintes quatro ramos distais a artéria carótida comum esquerda: artéria carótida externa, artéria carótida interna, artéria occipital e da artéria tireóidea superior. Estas embarcações, de tireóide, especialmente superior, pode ser frágil. Tenha muito cuidado com o seu esvaziamento.
  13. Empate fora da carótida externa ACIMA superior da tireóide 6-0 fio de seda. Para fazer isso, passe um fórceps debaixo da artéria e pegar um pedaço de sutura precut com a ajuda do seu fórceps outros. Puxe o fio para passar debaixo da artéria. Amarre firmemente evitando qualquer tecido circundante ser pego no nó. Se você amarrar abaixo da decolagem da artéria tireoidiana superior, até o final do procedimento você vai efetivamente ter realizado uma ligadura completa que é um modelo substancialmente diferente.
  14. Amarrar as artérias carótida interna e occipital, com um nó usando a mesma técnica.
  15. Verificar a posição de suturas e patência da artéria tireóidea superior.
  16. A pele ea pele aproximada perto usando uma pequena quantidade de tecido-Mend.
  17. Camundongos lugar em uma câmara de aquecimento até a recuperação. Recuperação normalmente leva 30 a 60 minutos.
  18. Uma única dose de buprenorfina (0.1mg/Kg) deve ser administrado imediatamente após a cirurgia, se a anestesia utilizada não proporcionar alívio da dor prolongada (ou seja, isoflurano inalado) ou se o animal está em perigo nas primeiras 24 horas. Em nossa experiência, a dose de quetamina administrada para anestesia fornece analgesia suficiente quando a cirurgia é realizada por cirurgião experiente e sem analgesia adicional é necessária.

2. Carótida exame ultra-sonográfico

  1. Para validar se a ligadura parcial induzida perturbado fluxo, fluxo carotídeo devem ser examinados um dia pós-ligadura
  2. Induzir a anestesia com isoflurano - caixa de indução da anestesia pode ser usada, se necessário
  3. Coloque os ratos anestesiados no palco de imagem, lado de barriga para cima
  4. Tape braços e pernas para ECG sensor de imagem no palco
  5. Desfolhar pescoço pela aplicação liberal de Nair (esta etapa só é necessária se não tiver feito para o procedimento ligadura)
  6. Insira o termômetro retal para registro de temperatura
  7. Aplique gel eco no pescoço
  8. Iniciar em modo-B.
  9. Plano de imagem deve ser de 90 graus (botão na sonda deve apontar para o nariz do mouse)
  10. Menor sonda para o pescoço do mouse até a imagem é obtida.
  11. Manipular estágio esquerda e direita até traquéia (mid-line estrutura) é identificado
  12. Identificar artéria carótida comum esquerda
  13. Estágio de imagem inclinação, para que um ângulo é criado entre o plano de imagem e da carótida. Quanto maior o ângulo isso, o forte é o sinal Doppler será.
  14. Lugar onda de pulso Doppler no meio da carótida comum esquerda.
  15. Use correção do ângulo, conforme necessário.
  16. Repetir as medições sobre a carótida comum direita.
  17. Ligadura parcial da carótida sucesso resultará em redução global no fluxo (~ 80-90%) na carótida comum esquerda em comparação com o lado direito, com reversão do fluxo de entrada para a aorta durante a diástole.
  18. Uma vez que as imagens foram satisfatórios obtidos, desligue a anestesia, limpe echo off gel ratos e camundongos livre de res fitatraints. Coloque os ratos na câmara de recuperação aquecido.

3. Isolamento de RNA íntima carótida

  1. Sacrifício camundongos por inalação de CO 2 de acordo com o protocolo institucional IACUC
  2. Tape as patas a uma toalha de papel.
  3. Cortar a pele do rato do abdômen para o topo do tórax.
  4. Abrir a parede abdominal abaixo da caixa torácica com uma tesoura afiada.
  5. Levantar o esterno com uma pinça e corte o diafragma e, em seguida cortar as costelas para expor o coração.
  6. Cortar a veia cava com uma tesoura.
  7. Perfundir pressão (120 mmHg) por 2 a 3 min com solução salina contendo 10 Unidades / mL de heparina através do ventrículo esquerdo até os pulmões e fígado tornar-se pálida.
  8. Cortar a pele do pescoço e remover toda a gordura, músculos e tecidos conectivos até as artérias carótidas são expostos.
  9. Posicione o mouse em um microscópio de dissecação.
  10. Punção um furo logo abaixo os sites ligadura na carótida esquerda para a segunda perfusão.
  11. Perfundir pressão novamente para min ~ 1 com soro fisiológico contendo 10 Unidades / mL de heparina através do ventrículo esquerdo, certificando-se a carótida esquerda é bem perused.
  12. Usando uma pinça de ponta fina e uma tesoura pequena mola, remova cuidadosamente os tecidos peri-adventícia ao redor das carótidas. Tenha cuidado para não espremer ou esticar a carótidas durante esta etapa de limpeza.
  13. Cortar a artéria carótida esquerda entre o arco aórtico e os pontos de ligação acima da bifurcação da carótida.
  14. Cortar a artéria carótida direita entre o ponto de ramificação da artéria subclávia direita e na bifurcação da carótida.
  15. Transferência das carótidas a um prato 35 milímetros cultura, contendo gelada HBSS. Se necessário, remova cuidadosamente qualquer tecido peri-adventícia restantes.
  16. Prepare uma seringa de insulina (3 / seringa de 10 ml) com uma agulha de 29G, preencha com 150 mL de buffer QIAsol lise (Qiagen) por cada carótida.
  17. Insira cuidadosamente a ponta da agulha em uma das extremidades da carótida.
  18. Enquanto mantém a carótida ea ponta da agulha com uma pinça, rapidamente (~ 1 seg) liberar o buffer de lise QIAsol (150 mL) em um tubo de 1,5 ml (eluato íntima).
  19. Lavar o restante da carótida (media + adventícia) de vez em HBSS, colocá-lo em um tubo de 1,5 ml, e encaixe-congelamento em nitrogênio líquido.
  20. Intima eluato e os restos congelados são então utilizados para o isolamento + íntima ou mídia RNA adventícia usando o mini-kit miRNeasy (QIAGEN), de acordo com as instruções do fabricante.

4. Resultados representativos:

Nós parcialmente ligada esquerdo do mouse artérias carótidas e ultra-sonografia foi realizada um dia após o procedimento. Conforme mostrado na Figura 1, ligadura parcial sucesso reduz a velocidade do fluxo sanguíneo e inverte o fluxo (fluxo perturbado) na artéria carótida comum esquerda durante a diástole. Ligadura parcial da ApoE knockout (KO) ratos acompanhados por uma dieta rica em gordura induz a aterosclerose robusta na artéria carótida comum esquerda (LCA), mas não na carótida direita contralateral, por duas semanas (Figura 2). RNA coletados a partir da íntima carótida contém genes marcadores endoteliais como PECAM-1, enquanto livre de medial do músculo liso genes de células marcador como um SMA (Figura 3).

Figura 1
Figura 1: Esquema da anatomia carótida e ligadura: Três ramos da artéria carótida comum esquerda (LCA) [artéria carótida externa (ACE), artéria carótida interna (ACI) e artéria occipital (OA)] foram ligados, deixando a artéria tireóidea superior (STA) aberto.

Figura 2
Figura 2: As imagens de ultra-som mostram perfis de velocidade de fluxo e revelam que a ligadura parcial induz inversão de fluxo (indicado por setas) na LCA durante a diástole. Fluxo em RCA permanece inalterado após a ligadura.

Figura 3
Figura 3: ligadura parcial e alto teor de gordura da dieta rapidamente induz aterosclerose em camundongos ApoE LCA de camundongos ApoE KO KO foram parcialmente ligada e alimentados com a dieta rica em gordura para 1-3 semanas.. Cortes congelados de LCA foram coradas com Oil Red-O-.

Figura 4
Figura 4. Método de preparação RNA íntima. RNA íntima e média + adventícia (m + a) RNA foram obtidos a partir sham-operado RCA e LCA em camundongos C57BL / 6. RNAs foram analisados ​​por semi-quantitativa de RT-PCR (A) e qPCR (B, C) ​​para PECAM-1 e α-SMA utilizando 18 anos como um controle interno. Gráficos de barras são média ± EPM, n = 3.

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Discussion

Neste procedimento, a identificação adequada de todos os ramos da carótida comum, incluindo a carótida externa, carótida interna, artéria occipital e da artéria tireóidea superior é essencial. Também é importante verificar o padrão de fluxo com ultra-som, como demonstrado. Em nossas mãos experientes, nossa taxa de sucesso de cirurgias ligadura parcial com base nos estudos de ultra-som de mais de 500 ratos é melhor do que 90%. Para a carótida preparações íntima RNA, é importante prestar atenção à aparência da carótida após a etapa de perfusão em primeiro lugar. Se houver evidência de bloqueio de fluxo na carótida comum esquerda, neste momento, nós não recomendamos usar essas amostras para análise posterior.

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Acknowledgments

Este trabalho foi financiado por recursos do NIH concede HL87012 (HJ), HL75209 (HJ), UO1HL80711 (DH, DG, HJ) e um World Class University Project (HJ) do Ministério da Ciência, Tecnologia e Educação de S. Korea.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Normal Saline (0.9% sodium chloride) Baxter Internationl Inc. 2B1323
Insulin syringe (3/10 ml 29g syringe) Tyco Healthcare, Covidien 8881600145
HBSS Cellgro 21-023
miRNeasy mini kit (including, QIAzol) Qiagen 217004
Vevo 770 High-Resolution Micro-Imaging System VisualSonics, inc. a.Visualsonics 770 system b.Imaging stage c.Vevo integrated rail system d.RMV scan head for mice or similar system
6-0 Silk Suture, sterile Covidien s-1172 c2
Small scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-5675 or similar
Dissecting Forceps Roboz Surgical Instruments Co. RS-5005 or similar
Tissue Mend II Webster Veterinary 07-856-7946

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References

  1. Korshunov, V. A., Berk, B. C. Flow-induced vascular remodeling in the mouse: a model for carotid intima-media thickening. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23, (12), 2185-2191 (2003).
  2. Sullivan, C. J., Hoying, J. B. Flow-dependent remodeling in the carotid artery of fibroblast growth factor-2 knockout mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22, (7), 1100-1105 (2002).
  3. Nam, D. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297, (4), H1535-H1543 (2009).

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