تحديد الظواهر المستحثة بواسطة تثبيط النمو البكتيري نوع من التعبير المستجيبات الثالث في الخميرة

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

في هذا الفيديو ، وصفنا إجراء للتعبير عن نوع البكتيريا المستجيبات الثالث في الخميرة وتحديد الظواهر التي يسببها المستجيب تثبيط النمو. ويمكن استغلال مثل هذه الظواهر في وقت لاحق لتوضيح مهام وأهداف المستجيب.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Salomon, D., Sessa, G. Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast. J. Vis. Exp. (37), e1865, doi:10.3791/1865 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

كثير من البكتيريا المسببة للأمراض سلبية الغرام استخدام إفراز النوع الثالث النظام لنقل من مكان لآخر مجموعة من البروتينات المستجيب في العصارة الخلوية للخلايا المضيفة. داخل الخلية ، اكتب المستجيبات الثالث تخريب عمليات المضيف الخلوية لقمع الاستجابات المناعية وتعزيز النمو الممرض. وقد تم تحديد العديد من نوع المستجيبات الثالث من مسببات الأمراض النباتية والحيوانية الجرثومية حتى الآن ، ولكن تتميز أيضا سوى عدد قليل منهم. فهم وظائف هذه المستجيبات قوضت من خلال مزيج من التكرار وظيفية في ذخيرة المستجيب لسلالة بكتيريا معينة ، الآثار الخفية التي قد تبذل لزيادة الفوعة ، والأدوار التي هي محددة ربما لمراحل عدوى معينة ، وصعوبات في وراثيا التلاعب مسببات معينة. التعبير عن المستجيبات النوع الثالث في الخميرة في مهدها

Protocol

أولا تصميم نظام الخميرة التعبير عن نوع المستجيبات الثالث

معايرة نظام الخميرة المناسبة للتعبير عن نوع المستجيب الثالث (ق) من الفائدة هو مهمة هامة وربما تتطلب بعض التجربة والخطأ. العوامل ذات الصلة الرئيسية التي ينبغي النظر فيها وتحسينها عند تصميم مثل هذا النظام هي : 1) مروج القيادة التعبير من 2 المستجيب و (ق)) عدد نسخ من الجين المستجيب ، 3) العلامة حاتمة استخدامها للتحقق من بروتين تعبير و 4) من سلالة الخميرة.

1) مروج

لأن البكتيريا نوع المستجيبات الثالث قد تكون سامة للخلايا الخميرة ، ينبغي أن يستخدم مروج محرض للسيطرة على التعبير عنها. ويشيع استخدام المروج GAL1 لهذا الغرض ويتم تنظيم النشاط من قبل مصدر الكربون الموجودة في النمو المتوسطة : يتم قمعها من قبل الجلوكوز والناجم عن اللبن. ومع ذلك ، أفيد هذا المروج كما تسرب طفيف في ظل الظروف الناشئة في قمع سمية غير مرغوب فيها. إذا واجه مشكلة مماثلة ، فإنه من المستحسن لتقليل عدد نسخ من الجين المستجيب على النحو المبين أدناه ، أو استعمال لمروجي محرض البديلة ، مثل المروجين MET3 أو CUP1 1. نحن هنا للتعبير عن وصف الإجراءات البروتينات المستجيب من المروج الغالاكتوز - محرض.

2) عدد النسخ الجيني

معلمة إضافية تؤثر في مستوى التعبير البروتين هو عدد نسخ الجين المستجيب موجودة في الخلية. وحققت مستويات عالية عندما يتم التعبير عن الجين المستجيب من 2 ميكرون البلازميد (40-60 نسخ لكل خلية) يتم الحصول على وسيطة التعبير باستخدام السنترومير المحتوية على البلازميد (نسخ لكل خلية 1-3) ، في حين يتحقق التعبير منخفضة عند دمج الجينات في جينوم المستجيب الخميرة التي تأشب مثلي. من خلال الجمع بين متجه السنترومير المحتوية على المروج وGAL1 أعربنا بنجاح حوالي 50 المستجيبات من مسببات الأمراض النباتية زانثوموناس campestris المنفط. الكهروضوئية والزائفة syringae الكهروضوئية. الطماطم على المستويات التي يمكن اكتشافها من خلال تحليل وطخة مناعية مع تسرب ضئيلة في ظل ظروف القمع (سالومون وسيسا ، غير منشور).

3) العلامة حاتمة

إذا الأجسام المضادة ضد المصالح المستجيب ليست متاحة ، وتنصهر علامة حاتمة للبروتين المستجيب لرصد التعبير من خلال طخة مناعية. العلامات شيوعا هي Myc ، راصة دموية (HA) ، أو العلم ، التي الأضداد التجارية الموثوقة المتاحة. نقترح استخدام نسخة واحدة فقط من العلامة للحد من آثار ضارة غير مرغوب فيها على بنية ونشاط البروتين المستجيب.

4) سلالة الخميرة

وهناك مطلب أساسي لسلالة الخميرة لاستخدامها في التعبير auxotrophy إلى علامة اختيار الناقل التعبير. ومن المهم أن نلاحظ أن سلالات مختلفة الخميرة قد يعرض حساسيات مختلفة في التعبير من المستجيبات معينة. على سبيل المثال ، لاحظنا أن سلالات BY4741 W303 وحساسيات مختلفة لعدة زانثوموناس campestris الكهروضوئية المستجيبات المنفط (سالومون وسيسا ، بحث غير منشور). لذا ، فمن الأفضل لاختبار المستجيب (ق) من الاهتمام في مختلف سلالات الخميرة.

II. إعداد الخميرة وسائل الإعلام

لنمو سلالات الخميرة التي لا تحتوي على أي متجه ، استخدم YPD (10 خلاصة الخميرة ز / لتر ، و 20 غرام / لتر ببتون و 2 ٪ الجلوكوز [ث / ت]) باعتبارها وسيلة النمو. لوسائل الإعلام الصلبة ، إضافة 2 ٪ [ث / V] آغار إلى الحل (إذا كان وسيلة قوية لينة جدا ، إضافة 0.05 ٪ [V / V] من محلول هيدروكسيد الصوديوم الأسهم N 5 إلى متوسطة قبل التعقيم). نوصي بإعداد وسيط وبدون سكر في 90 ٪ من حجم والتعقيم النهائي عليه. قبل وقت قصير من استخدامها ، وملء وحدة التخزين إلى 100 ٪ مع فلتر تعقيم 20 ٪ [ث / V] حل الجلوكوز (السكر في الحفاظ على حل 20 ٪ في 4 درجات مئوية لمنع التلوث).

لنمو سلالات الخميرة التي تحتوي على ناقل يوفر prototrophy لاختيار علامة (ليسين ، اليوراسيل ، أو الحامض الاميني التربتوفان) ، واستخدام الاصطناعية التسرب وسيط وبدون يسين ، اليوراسيل ، والحامض الاميني التربتوفان (6.7 النيتروجين الخميرة ز / L قاعدتها دون الأحماض الأمينية ، 1.4 غرام / لتر الخميرة الاصطناعية التسرب تكملة المتوسطة) والتي تحتوي على 2 ٪ [ث / V] الجلوكوز ، أو 2 ٪ [ث / V] الجلاكتوز و 1 ٪ [ث / V] الرافينوز. لوسائل الإعلام الصلبة ، إضافة 2 ٪ [ث / V] آغار إلى الحل. نوصي بإعداد المتوسط ​​في 90 ٪ من حجم والتعقيم النهائي عليه. قبل وقت قصير من استخدامها ، وملء وحدة التخزين إلى 100 ٪ مع حل فلتر تعقيم الجلوكوز 20 ٪ ، أو اللبن فلتر تعقيم 20 ٪ + 10 ٪ حل رافينوز ، اعتمادا على مصدر الكربون المطلوب (الحفاظ على نسبة الجلوكوز 20 ٪ و 20 ٪ الجلاكتوز + حلول رافينوز 10 ٪ في 4 درجات مئوية لمنع التلوث). اعتمادا على اختيار علامة من مركزنا التعبيرتور ، إضافة الأحماض الأمينية الأخرى أو اليوراسيل قبل استخدام (10 مل / لتر من 1 g/100 الأسهم يسين مل و 10 مل / لتر من 200 مل mg/100 الأسهم اليوراسيل ، 2 مل / لتر من g/100 1 (أ) مل الأسهم الحامض الاميني ، أو 2 مل / لتر من 1 g/100 الأسهم التربتوفان مل). عندما تستعد ليسين واليوراسيل الأسهم وتعقيم لهم من قبل التعقيم والحفاظ على درجة حرارة الغرفة. عند إعداد والحامض الاميني التربتوفان الأسهم وتعقيم لهم الترشيح ، والتفاف مع زجاجة رقائق الألومنيوم للحماية من الضوء ، والحفاظ على 4 درجات مئوية. في الإجراءات المذكورة أدناه ، الاصطناعية التسرب المتوسطة تستكمل مع يسين ، تم تعيينه اليوراسيل ، والحامض الاميني التربتوفان والمتوسطة كاملة الاصطناعية.

ويمكن تخزين صلبة وسائل الإعلام لوحات لمدة تصل الى شهرين في 4 درجة مئوية. قبل الاستخدام ، لوحات جافة لمدة 20 دقيقة في غطاء تدفق الصفحي معقمة في درجة حرارة الغرفة.

III. الخميرة تحويل

  1. قبل البدء في إجراء تحول الخميرة ، وإعداد الحلول الثلاثة التالية : 50 ٪ [ث / V] البولي ايثيلين جلايكول (PEG) 3350 حل ، والحل 1 LiAc M الرقم الهيدروجيني = 8.0 ، وإيجاد حل TE (100 ملي تريس = 6.85 درجة الحموضة و 10 ملي EDTA الرقم الهيدروجيني = 8.0). فلتر تعقيم الحلول والحفاظ على 4 درجات مئوية.
  2. باستخدام رمح خشبي طويل أو حلقة التلقيح المعقمة ، واختيار مستعمرة الخميرة (1-2 مم) من لوحة جديدة وتطعيم 3 مل من YPD في أنبوب البولي بروبلين 15 مل. دوامة لفترة وجيزة. وضع أنبوب الثقافة في الأسطوانة ، واحتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع دوران مستمر.
  3. في الصباح ، وإزالة ثقافة من الدوارة وأجهزة الطرد المركزي في 800 غ لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، تماما إزالة طاف.
  4. Resuspend الخلايا في 1 مل العازلة إعادة تعليق (10 ٪ [V / V] TE الحل ، و 10 ٪ [V / V] (1) حل LiAc M) ومزيج من قبل vortexing.
  5. لكل البلازميد أن تتحول السيطرة والتحول إضافية ، ونقل 100 ميكرولتر من تعليق خلية إلى microtube.
  6. لكل أنبوب ، وإضافة 5 ميكرولتر من سمك السلمون واحدة حبلا الحمض النووي الحيوانات المنوية (10 ملغ / مل) ، و250-500 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد أن تتحول (باستثناء أنبوب التحكم).
  7. إضافة بعناية إلى كل ميكرولتر 650 أنبوب حل التحول (10 ٪ [V / V] TE الحل ، و 10 ٪ [V / V] (1) حل LiAc M ، و 80 ٪ [V / V] 50 ٪ [ث / V] حل PEG ) ودوامة.
  8. احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على أسطوانات.
  9. إزالة أنابيب من شاكر ، إضافة 70 ميكرولتر من DMSO ، وتخلط بواسطة أنابيب في قلب 10-15 مرات (لا لتجنب دوامة كسر الخلايا).
  10. وضع الأنابيب في درجة حرارة 42 درجة مئوية حمام ماء قبل تحسنت واحتضان لمدة 15 دقيقة.
  11. إزالة أنابيب المياه من حوض الاستحمام ومكان على الفور على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  12. مرة واحدة في أنابيب وتبريده ، طرد مركزي لهم في 800 غ لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  13. تتخذ أنابيب من microcentrifuge وإزالة بعناية طاف لزج باستخدام pipettor.
  14. Resuspend الكرية خلية من كل أنبوب في 150 ميكرو لتر من الماء المقطر المعقم مزدوجة (أحواض دبي الجافة العالمية) ، ونشر التعليق الخلية على لوحة كاملة المتوسطة الاصطناعية التي تحتوي على 2 ٪ الجلوكوز كمصدر الكربون وبدون الأحماض الأمينية أو النوكليوتيدات الذي ينص على البلازميد prototrophy.
  15. إجازة مفتوحة لوحات لمدة 2 دقيقة والسماح لهم الجافة في تدفق الصفحي هود. وضع لوحات في الحاضنة 30 درجة مئوية لمدة سنتين في ثلاثة أيام.
  16. المستعمرات مرة واحدة (1-2 مم) وقد ظهرت على لوحات ، واختيار ما يقرب من 10 مستعمرة واحدة من كل التحولات ونقلها إلى لوحة جديدة. عند نقل المستعمرات ، وجعل 2 سم × 2 سم للسماح للبقع نمو كمية كبيرة من خلايا الخميرة. احتضان لوحات في حاضنة على 30 درجة مئوية لمدة يومين.
  17. عندما بقع الخميرة ونمت ، وإزالة لوحات من الحاضنة وختم لهم parafilm. ويمكن تخزين لوحات في 4 درجة مئوية. نقل المستعمرات إلى لوحة جديدة كل يوم 10-14.

رابعا. إعداد الخميرة استخراج البروتين إلى التحقق من التعبير بواسطة المستجيب طخة مناعية

  1. اختيار مستعمرة الخميرة (1-2 مم) من لوحة جديدة لأنبوب البولي بروبلين 15 مل تحتوي على 3 مل من وسيلة مناسبة كاملة الاصطناعية تستكمل مع 2 ٪ الجلوكوز كمصدر الكربون وبدون الأحماض الأمينية أو النوكليوتيدات إلى البلازميد والتي اختيار يوفر prototrophy. وضع أنبوب الثقافة في الأسطوانة ، واحتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
  2. في اليوم التالي ، وإزالة ثقافة من الدوارة وأجهزة الطرد المركزي في 800 غ لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة أنابيب من أجهزة الطرد المركزي والتخلص من طاف.
  3. Resuspend الكرية خلية في 3 مل من مزيج أحواض دبي الجافة العالمية العقيمة والتي vortexing.
  4. الطرد المركزي مرة أخرى ، تجاهل الخلايا طاف ، وresuspend في 3 مل من أحواض دبي الجافة العالمية العقيمة.
  5. نقل 200 ميكرولتر من تعليق خلية إلى أنبوب جديد 15 مل تحتوي على 3 مل من المتوسط ​​الشامل الاصطناعية تستكمل مع اللبن 2 ٪ و 1 ٪ رافينوز كمصدر الكربون ، ودون أن الأحماض الأمينية أو النوكليوتيدات إلى البلازميد الذي يتيح اختيار prototrophy.مزيج من قبل vortexing ، ضع في الأسطوانة ، واحتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
  6. في صباح اليوم التالي ، نقل 1 مل من ثقافة (أو أكثر للثقافات منخفض الكثافة) إلى microtube. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 800 غ لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  7. من هنا ، عمل في غطاء محرك السيارة لتجنب الدخان التنفس β - المركابتويثانول الأبخرة السامة. إزالة بعناية طاف باستخدام pipettor وresuspend الكرية الخلية في 100 ميكرولتر من الجليد الباردة حل تحلل (4 ٪ [V / V] 5 N هيدروكسيد الصوديوم ، 0.5 ٪ [V / V] β - المركابتويثانول). مزيج بقوة vortexing واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  8. أثناء الحضانة ، وتحديد حجم حمض الهيدروكلوريك (6 N) المطلوبة لtitering 100 ميكرولتر من تحلل العازلة لدرجة الحموضة 9-10. لتحقيق هذا الهدف ، وضع 10 في microtubes ميكرولتر 100 الرف ونقل العازلة تحلل في كل منها. إضافة وحدات مختلفة (1-10 ميكروليتر) من حمض الهيدروكلوريك (6 ن) لكل أنبوب وتخلط بواسطة vortexing. أخذ عينة وفحص الرقم الهيدروجيني من الحل باستخدام شريط مؤشر الرقم الهيدروجيني.
  9. في نهاية الحضانة ، إضافة حجم حمض الهيدروكلوريك تحديده في الخطوة السابقة إلى lysate وتخلط بواسطة vortexing (لتحسين دقة ووضع حل حمض الهيدروكلوريك على جانب الأنبوب دون إدراج تلميح الى lysate).
  10. إضافة ميكرولتر من 50 عينة العازلة 3X (30 ٪ [V / V] الجلسرين ، و 15 ٪ [V / V] β - المركابتويثانول ، 37.5 ٪ [V / V] 500 ملم تريس ، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة = 6.8 ، 0.15 ٪ [ث / ت ] كبريتات الصوديوم دوديسيل [SDS] وعدد قليل من الحبوب من اللون الأزرق bromophenol) إلى lysate وتخلط بواسطة vortexing (إذا كان هذا الحل يتحول إلى اللون الأصفر ، فهذا يعني أن درجة الحموضة منخفضة جدا ، وينبغي أن يضاف قليل من حل microliters تحلل حتى الحل اللون الأزرق).
  11. غلي حل lysate لمدة 5 دقائق على كتلة التدفئة بعد ثقب ثقبا في غطاء microtube بإبرة.
  12. إزالة microtube من كتلة التدفئة ويسمح الحل لتهدئة لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  13. دوامة الحل lysate ثم تدور عليه لمدة 10 ثانية. تحميل 30 ميكرولتر على جل SDS - PAGE لتحليل طخة مناعية.

خامسا الإكتشاف الفحص لكشف الظواهر التي يسببها المستجيب إعاقة النمو

  1. لوحة جديدة من اختيار مستعمرة الخميرة (1-2 مم) تحمل التعبير البلازميد من الاهتمام وتطعيم ، في أنبوب 15 مل البولي بروبلين و 3 مل من المتوسط ​​الشامل الاصطناعية تستكمل مع 2 ٪ الجلوكوز كمصدر الكربون ودون الأمينية حمض أو النوكليوتيدات الذي يتيح التعبير البلازميد prototrophy. كرر نفس الإجراء لمكافحة سلالة الخميرة يحمل البلازميد فارغة. وضع أنابيب الثقافة في الأسطوانة ، واحتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع دوران مستمر.
  2. في اليوم التالي ، إزالة الثقافات من الأسطوانة والطرد المركزي في 800 غ لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة أنابيب من أجهزة الطرد المركزي والتخلص من طاف.
  3. Resuspend الكرية خلية في 3 مل من مزيج أحواض دبي الجافة العالمية العقيمة والتي vortexing.
  4. كرر الخطوة الطرد المركزي والخلايا resuspend في 3 مل من أحواض دبي الجافة العالمية العقيمة.
  5. لتحديد كثافتها الضوئية (OD) ، ونقل 100 ميكرولتر من كل ثقافة إلى microtube تحتوي على 900 وأحواض دبي الجافة العالمية ميكرولتر الدوامة. صب محتويات الأنابيب البلاستيكية في كفيت وقياس الامتصاصية في الطول الموجي من 600 نانومتر (يستعمل مثل مرجع كفيت مليئة 1 مل من أحواض دبي الجافة العالمية). حساب OD 600 من الثقافات الأولي بضرب OD 600 من الثقافات في كفيت بعامل التخفيف من 10.
  6. المقبل ، استنادا إلى OD 600 من الثقافات الأولية ، وإعداد تعليق خلية (1 مل) مع OD 600 = 1.0 في microtubes العقيمة.
  7. باستخدام 3 microtubes العقيمة مليئة أحواض دبي الجافة العالمية 900 ميكرولتر العقيمة ، إعداد ثلاث مرات 10 التخفيفات المتسلسلة (OD 600 = 0.1 ، 0.01 و 0.001) من كل خلية تعليق (OD 600 = 1.0) أعد في الخطوة السابقة.
  8. إعداد صفيحتين تحتوي المتوسطة كاملة الاصطناعية دون الحمض الأميني أو النوكليوتيدات إلى البلازميد الذي يتيح اختيار prototrophy. ينبغي أن تستكمل لوحة واحدة متوسطة مع الجلوكوز 2 ٪ وذلك من لوحة أخرى مع اللبن 2 ٪ و 1 ٪ الرافينوز. لوحات الجافة في غطاء تدفق الصفحي معقمة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة ووضعها على الشبكة.
  9. لكل ثقافة ، بقعة 10 ميكرولتر من التخفيفات في أربع مباريات متتالية على قمع كل من حمل وسائل الاعلام.
  10. بعد اكتشاف ، وترك لوحات مفتوحة في غطاء محرك السيارة لعدة دقائق. عندما بقع جافة ، وتغطي لوحات ووضعها في الحاضنة 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام.
  11. بعد مرور فترة الحضانة ، واخراج لوحات وتحليل نمو الخميرة. أولا ، التأكيد على أن كثافة خلية مماثلة على لوحة تحتوي على قمع المتوسطة. ثم ، قارن نمو ثقافة التعبير عن بروتين المستجيب في المصالح مع ثقافة يحمل ناقلات الفارغة على لوحة تحتوي على تحريض المتوسطة.

    ملاحظة : المستجيبات التي قد تستهدفها العمليات الخلوية التي لا تحد من معدل نمو الخميرة تحت ظروف النمو القياسية المختبر.السماح لتحديد الظواهر تثبيط نمو هذه المستجيبات ، يمكن استكمال وسائل الاعلام مع إحداث تغيير المركبات التي الخميرة الوظائف الخلوية ، مما يزيد من حساسيتها للمستجيبات. للحصول على قائمة من المواد الكيميائية التي ربما يمكن أن تكون متكاملة في هذا الإجراء ، تشير إلى بارسونز وآخرون. (2004) 2.

سادسا. ممثل النتائج

ويرد ممثل الخميرة اكتشاف الفحص والكشف عن الظواهر تثبيط النمو الناجم عن التعبير عن المستجيبات النوع الثالث في الشكل. 1. في هذه التجربة ، وأعرب عن النوع الثالث المستجيبات AvrPto ، HopAA1 - 1 و AvrE1 ممرض للنبات للبكتيريا سالبة الجرام الزائفة syringae الطماطم. الكهروضوئية (PST) من pGML10 السنترومير المحتوية على البلازميد في سلالة BY4741 الخميرة ، واختبار لقدرتهم لكبح نمو الخميرة. وكانت مخففة متسلسل الثقافات الفردية في الخميرة معربا عن توقيت المحيط الهادي نوع المستجيبات الثالث تحت سيطرة المروج الغالاكتوز GAL1 محرض أو التي تحتوي على ناقلات الفارغة ومطلي على قمع (الجلوكوز) أو حمل (اللبن) وسائل الاعلام (الشكل 1). على قمع المتوسطة ، وعرض سلالات الخميرة تحمل البلازميدات للتعبير عن وAvrPto HopAA1 1 - نمو مماثلة لسلالة تحكم يحتوي على ناقلات فارغة. لكن على المديين المتوسط ​​نفسه ، الخميرة تحمل AvrE1 عرض انخفاض معدل النمو قليلا ، وربما ترتبط إلى حد ما تسرب من المروج GAL1 وتأثير ارتفاع AvrE1 السامة للخلايا. في الظروف المحفزة ، تسببت تعبير عن المستجيب AvrE1 ظهر تعطل النمو جذرية النمط الظاهري التي يعكسها عدم وجود أي مستعمرات في التخفيف. كما لوحظ من قبل Munkvold وآخرون. 3 ، والتعبير عن 1 - HopAA1 أسفرت أيضا عن تثبيط حاد في النمو ، في حين AvrPto لم تظهر أي تأثير.

الشكل 1
الشكل 1. الخميرة تثبيط النمو الناجم عن التعبير عن الطماطم syringae الزائفة. الكهروضوئية (PST) نوع المستجيبات الثالث AvrE1 وHopAA1 - 1. سلالات الخميرة (BY4741) التي تحتوي على البلازميد pGML10 ، إما فارغة أو تحمل GAL1 يحركها أشرطة لالغالاكتوز - محرض التعبير عن AvrPto ، كانت تزرع HopAA1 - 1 أو AvrE1 ، بين عشية وضحاها في المتوسط ​​الشامل الاصطناعية تستكمل مع الجلوكوز (2 ٪) كمصدر الكربون ، وتفتقر ليسين. وجرفت المياه الثقافات ، إلى تطبيع OD 600 شوهدت = 1.0 و المسلسل التخفيفات 10 أضعاف على وسائط الاصطناعية الصلبة كاملة تفتقر ليسين والجلوكوز التي تحتوي على (2 ٪) ، أو اللبن (2 ٪) ورافينوز (1 ٪). وقد اتخذت صورا بعد 2 و 3 أيام للنمو في 30 درجة مئوية لمدة الخميرة المتنامي في الجلوكوز وسكر اللبن وسائل الاعلام ، على التوالي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا العرض ، ويتضح لنا كيفية استخدام الخميرة في مهدها السكيراء خميرة كنظام مغاير للتعبير عن البروتينات النوع الثالث المستجيب البكتيرية وكيفية التعرف على الظواهر التي يسببها المستجيب تثبيط النمو. الأهم من ذلك ، يمكن استخدام هذه الظواهر في شاشات الجينية لتحديد المكثفات من تأثير سلبي على النمو من المستجيبات الخميرة. المكثفات قد تمثل إما أهدافا مباشرة للدرس المستجيب أو البروتينات التي تشارك في العمليات الخلوية تتأثر المستجيب. وقد أعرب العديد من نوع المستجيبات الثالث من مسببات الأمراض الحيوانية والنباتية البكتيرية في الخميرة حتى الآن ، وكانت تستخدم لإعاقة النمو الظواهر التي تسببها العديد منهم للتعرف على العمليات أو الممرات التي كانت 1،4 هدف. في العديد من الدراسات ، كما في الخميرة سمية المستجيب استغلالها بنجاح لتحديد المستجيبات البكتيرية رواية 5. وعلاوة على ذلك ، قد يتم استغلالها المستجيب الظواهر الناجمة عن إعاقة النمو لاكتشاف المخدرات في شاشات المكتبات الكيميائية للمركبات التي تقمع سمية المستجيبات في الخميرة 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم اسرائيل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast extract Difco Laboratories 212750
Peptone Difco Laboratories 211677
D-glucose Sigma-Aldrich G5767
Agar Difco Laboratories 214010
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S8045
Yeast nitrogen base w/o amino acids Difco Laboratories 291940
Yeast synthetic drop-out medium supplement Sigma-Aldrich Y2001
D-galactose Sigma-Aldrich G0750 >99%; <0.1% glucose
D-raffinose Sigma-Aldrich R0250 >98%
L-leucine Sigma-Aldrich L8000
Uracil Sigma-Aldrich U0750
L-tryptophan Sigma-Aldrich T0254
L-histidine Sigma-Aldrich H6034
DNA, single stranded, from salmon testes Sigma-Aldrich D7656
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D5879 Desiccate
Hydrochloric acid (HCl) Sigma-Aldrich H1758
Polyethylene glycol (PEG) 3350 Sigma-Aldrich P4338
Lithium acetate (LiAc) Sigma-Aldrich L4958
Tris (base) JT Baker 4109-02
Ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E5134
β-mercapt–thanol Sigma-Aldrich M6250
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B6131
Dodecyl sulfate sodium salt (SDS) Merck & Co., Inc. 8.22050.1000
Centrifuge tubes (15 ml) Corning 430052 Sterile
Spectrophotometer cuvette (10x4x45 mm) Sarstedt Ltd 67.742
Inoculation loop Sigma-Aldrich Z643009 Sterile
Parafilm Sigma-Aldrich P7543
pH indicator strip, pH 6.5-10.0 Merck & Co., Inc. 1.09543.0001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siggers, K. A., Lesser, C. F. The yeast Saccharomyces cerevisiae: a versatile model system for the identification and characterization of bacterial virulence proteins. Cell Host Microbe. 4, 8-15 (2008).
  2. Parsons, A. B. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat. Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
  3. Munkvold, K. R., Martin, M. E., Bronstein, P. A., Collmer, A. A survey of the Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion system effector repertoire reveals several effectors that are deleterious when expressed in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Plant-Microbe Interact. 21, 490-502 (2008).
  4. Curak, J., Rohde, J., Stagljar, I. Yeast as a tool to study bacterial effectors. Curr. Opin. Microbiol. 12, 18-23 (2009).
  5. Slagowski, N. L., Kramer, R. W., Morrison, M. F., LaBaer, J., Lesser, C. F. A functional genomic yeast screen to identify pathogenic bacterial proteins. PLoS Pathog. 4, e9-e9 (2008).
  6. Huang, J., Lesser, C. F., Lory, S. The essential role of the CopN protein in Chlamydia pneumoniae intracellular growth. Nature. 456, 112-115 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics