रूका प्रवाह तरीके कैनेटीक्स के आवेदन के लिए एक डीएनए मरम्मत प्रोटीन की कार्रवाई के तंत्र की जांच

Published 3/31/2010
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Biology

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Summary

Msh2 - Msh6 डीएनए में प्रतिकृति त्रुटियों की मरम्मत की शुरुआत के लिए जिम्मेदार है. यहाँ हम समझने की दिशा में एक क्षणिक कैनेटीक्स दृष्टिकोण है कैसे काम करता है इस महत्वपूर्ण प्रोटीन मौजूद है. रिपोर्ट मिलकर डीएनए बाध्यकारी और ATPase कैनेटीक्स अंतर्निहित डीएनए की मरम्मत में Msh2 Msh6 कार्रवाई के तंत्र को मापने के लिए बंद कर दिया प्रवाह के प्रयोगों को दिखाता है.

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Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein. J. Vis. Exp. (37), e1874, doi:10.3791/1874 (2010).

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Abstract

Protocol

Msh2 - Msh6 डीएनए बाध्यकारी कैनेटीक्स ए मापन

1. Msh2 Msh6 डीएनए बाध्यकारी कैनेटीक्स प्रयोग के लिए नमूना तैयार

प्रतिदीप्ति आधारित एक बंद कर दिया प्रवाह पर गतिज डीएनए बाध्यकारी प्रयोग के लिए अभिकर्मकों तैयार fluorometer पर एक संतुलन के प्रयोग के लिए करने के लिए इसी तरह की है. दरअसल संतुलन बाध्यकारी विश्लेषण पहली बार प्रदर्शन किया जाना चाहिए करने के लिए बातचीत के लिए पृथक्करण स्थिरांक (डी कश्मीर) का अनुमान करने में गतिज विश्लेषण के लिए स्थितियों की प्रतिक्रिया का अनुकूलन. रूका प्रवाह प्रयोगों संतुलन या स्थिर राज्य प्रयोगों के साथ तुलना में बड़ा जैविक सामग्री की मात्रा की आवश्यकता होती है, इसलिए सबसे व्यावहारिक दृष्टिकोण है, जब प्रोटीन की कम milligram मात्रा में उपलब्ध हैं 11,12 और ligands के समान मात्रा में तैयार किया जा सकता है या खरीदा.

  1. हम एस अधिक व्यक्त ई. में Msh2 Msh6 cerevisiae कोलाई और आयन विनिमय क्रोमैटोग्राफी (छवि 1) 11 के द्वारा प्रोटीन की शुद्ध milligram मात्रा .
  2. डीएनए अभिकर्मकों के साथ या 2 Aminopurine fluorophore बिना रासायनिक संश्लेषित किया जा सकता है. हम 37 nucleotide लंबाई एकल असहाय 2 - Aminopurine के साथ संशोधित DNAs खरीद और एक जी के निकट 2 - Aminopurine साथ द्वैध डीएनए तैयार: टी बेमेल (छवि 2) के लिए दो पूरक किस्में पानी रखना. डीएनए polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन denaturing द्वारा निर्माता द्वारा या प्रयोगशाला में शुद्ध किया जा सकता है, बाद आम तौर पर उच्च पैदावार देता है.
  3. (2 - एपी) टी डीएनए और डीएनए बाध्यकारी बफर में Msh2 - Msh6 प्रोटीन के नमूने (20 Tris - एचसीएल मिमी, पीएच 8.0, 5 मिमी 2 MgCl, 100 मिमी NaCl): डीएनए बाध्यकारी कैनेटीक्स के लिए, अलग जी तैयार है. Msh2 - Msh6 और डीएनए सांद्रता 0.8 सुक्ष्ममापी और क्रमश: 0.12 सुक्ष्ममापी, जो 1:01 मिश्रण अनुपात के साथ एक एकल मिश्रण का प्रयोग में 0.4 सुक्ष्ममापी और पैदावार 0.06 सुक्ष्ममापी अंतिम सांद्रता हैं. टी (2 - एपी) डीएनए, और 8 जी unlabeled सुक्ष्ममापी के साथ एक और नमूना: डीएनए हदबंदी कैनेटीक्स के लिए, एक 0.8 सुक्ष्ममापी Msh2 Msh6 और 0.12 सुक्ष्ममापी जी युक्त नमूना तैयार मुक्त Msh2 Msh6 के लिए एक जाल के रूप में टी डीएनए. तैयार है और बर्फ पर नमूनों की दुकान. इन प्रतिक्रियाओं में प्रोटीन एकाग्रता Msh2 Msh6 डीएनए बातचीत और डीएनए एकाग्रता के लिए 10 एनएम कश्मीर विकास अच्छी तरह से ऊपर है एक मजबूत प्रतिदीप्ति संकेत के लिए पर्याप्त है (empirically निर्धारित ) है. नमूना प्रति 400 μl की मात्रा के बारे में 10 गतिज निशान (तालिका 1) प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है.
  4. उच्च गुणवत्ता वाले रसायनों का उपयोग करें कि प्रोटीन, डीएनए, और बफर तैयारी में फ्लोरोसेंट दोष मुक्त कर रहे हैं. 0.2 सुक्ष्ममापी particulates के साथ बंद कर दिया प्रवाह clogging से बचने झिल्ली के माध्यम से सभी बफ़र्स फ़िल्टर.
  5. यदि fluorophore दृश्य प्रकाश, तैयारी और प्रयोग अवशोषण कम प्रकाश स्थितियों के तहत किया जाना चाहिए.

2. Msh2 Msh6 डीएनए बाध्यकारी कैनेटीक्स के लिए साधन की तैयारी

सिद्धांत रूप में एक साधन रोका प्रवाह काफी सरल है. यह एक ड्राइव मोटर का उपयोग करता है एक मिश्रण डिवाइस में तेजी से ड्राइव सीरिंज में दो समाधान धक्का, मिश्रित समाधान तो डेटा संग्रह (3 छवि) के लिए एक अवलोकन कक्ष में बहती है. हम उपयोग KinTek रोका प्रवाह है, जो कम नमूना मात्रा की आवश्यकता है, ऑप्टिकल संकेतों की एक किस्म के एकल या reactants के अनुक्रमिक मिश्रण, पता लगाने की अनुमति देता है, और बहुत उपयोग करने के लिए आसान है है. रूका प्रवाह उपकरणों के कई अन्य निर्माताओं से उपलब्ध के रूप में अच्छी तरह से कर रहे हैं.

  1. आदेश में प्रयोगों के लिए बंद कर दिया प्रवाह साधन तैयार करने के लिए, सुनिश्चित करें कि कंप्यूटर और नियंत्रक बंद कर दिया जाता है. दीपक शांत करने के लिए परिसंचारी पानी परिवेश के तापमान के लिए सेट स्नान (25 डिग्री; सी) पर मुड़ें. दीपक प्रज्वलित. Monochromator वांछित उत्तेजना तरंगदैर्ध्य (2-Aminopurine के मामले में 315 एनएम) के लिए सेट करें. वांछित भट्ठा चौड़ाई (कम photobleaching साथ empirically संतुलन उच्च fluorophore उत्तेजना) भट्ठा पहिया मुड़ें. नियंत्रक और कंप्यूटर पर मुड़ें. परिसंचारी पानी के स्नान के लिए पानी जैकेट है कि एक वांछित तापमान पर प्रयोग के दौरान (30 ° सी एस cerevisiae Msh2 - Msh6 के मामले में) reactants रखता है को भरने पर मुड़ें.
  2. अगले बंद कर दिया प्रवाह कार्यक्रम पर अमल. पसंद है, जो इस मामले में एक हस्तक्षेप के फिल्टर के साथ एक फोटोमल्टिप्लायर ट्यूब (PMT) fluorophore (350 एनएम कटौती बंद 2 - Aminopurine के मामले में फिल्टर) के लिए उपयुक्त है की डिटेक्टर पर मुड़ें. PMT वोल्टेज लागू करें. अंधेरे वर्तमान को मापने के लिए किसी भी पृष्ठभूमि बिजली के शोर के लिए सही है.
  3. रोका प्रवाह ड्राइव सीरिंज और प्रेक्षण सेल के नमूने लोड हो रहा है पहले धोया जाना चाहिए. नमूना लोड हो रहा है लोड स्थिति के लिए वाल्व सेट. विआयनीकृत, फ़िल्टर्ड पानी के साथ एक 1ml सिरिंज भरें, यह लोड हो रहा है ड्राइव सिरिंज के नीचे स्थित बंदरगाह करने के लिए देते हैं, और मैन्युअल रूप से दो एक बार कुछ सीरिंज के बीच पानी में धक्का. प्रत्येक ड्राइव करने के लिए प्रयोग में इस्तेमाल किया जा सिरिंज के लिए प्रक्रिया को दो बार दोहराएँ. अगला, पानी के साथ ड्राइव सीरिंज अवलोकन कक्ष धोने के लिए भरें. आग की स्थिति के लिए नमूना लोड हो रहा है वाल्व स्विच. समायोजित सिरिंज ड्राइव का प्रयोग करेंआदेश, जो ड्राइव मोटर और कम ड्राइव अवलोकन सेल के माध्यम से और बाहर निकलें लाइन में पानी धक्का प्लेट नियंत्रण. ड्राइव सिरिंज के बहुत अंत में सवार धक्का नहीं ख्याल रखना. ड्राइव थाली उठाएँ. लोड स्थिति के लिए वाल्व स्विच. बफर के साथ प्रतिक्रिया मैन्युअल सीरिंज धोने और खाली छोड़. साधन अब इस्तेमाल के लिए तैयार है.

3. Msh2 - Msh6 डीएनए बाध्यकारी प्रयोग और डेटा विश्लेषण

  1. ट्यूब से एक ताजा 1 मिलीलीटर सिरिंज प्रत्येक नमूने स्थानांतरण. एक लोडिंग बंदरगाह के लिए प्रत्येक नमूना सिरिंज संलग्न और ड्राइव सिरिंज में समाधान धक्का. ध्यान रखना करने के लिए मैन्युअल रूप से दो सीरिंज आंतरायिक के साथ एक कुछ समय pauses के बीच समाधान धक्का द्वारा सभी हवाई बुलबुले को दूर. ड्राइव थाली कम जब तक यह ड्राइव सीरिंज के शीर्ष संपर्क. Reactants कुछ मिनट के लिए परिवेश के तापमान को संतुलित करते हैं.
  2. डेटा संग्रह के लिए निर्धारित समय / चैनल विंडो खोलते हैं, तो डेटा संग्रह चैनल (PMT), मोड डेटा विश्लेषण के (प्रतिदीप्ति) चुनें, और निशान (मदपान) की संख्या में एकत्र होने के लिए. डेटा संग्रह जो समय के दौरान 1000 डेटा बिंदुओं एकत्र किया जाएगा दर्ज करें. एक अज्ञात प्रतिक्रिया कई सेकंड से अधिक निगरानी की जानी चाहिए क्रम में किसी भी धीमी चरणों का पता लगाने के लिए. Empirically संतुलन या स्थिर राज्य और सेट डेटा संग्रह ≥ 6 आधा जीवन समय तक पहुँचने के लिए आवश्यक समय का अनुमान. Msh2 - Msh6 के मामले में इष्टतम समय सीमा जी के लिए 2 सेकंड है: टी हदबंदी कैनेटीक्स: टी बेमेल बाध्यकारी और जी के लिए कैनेटीक्स 60 सेकंड. अब आग की स्थिति के लिए वाल्व सेट और डेटा एकत्रित करें बटन पर क्लिक करें. यह क्रिया अवलोकन कक्ष, 2-Aminopurine fluorophore की उत्तेजना और समय पर प्रतिदीप्ति संकेत के संग्रह में Msh2 - Msh6 और डीएनए, प्रतिक्रिया की प्रविष्टि का मिश्रण शुरू. कम से कम 5 गतिज निशान लीजिए करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त करने के लिए और फ़ाइल सहेजें.
  3. जब प्रयोग पूरा हो गया है, दीपक की बारी है. पानी से धो सीरिंज और प्रेक्षण सेल के रूप में पहले वर्णित है. फिर, बंद परिसंचारी पानी के स्नान के लिए छोड़कर बाकी उपकरणों की बारी है,. एक अतिरिक्त 15 मिनट दीपक शांत पानी के लिए परिचालित किया जाता है.
  4. गणित आपरेशनों और डेटा फिटिंग KinTek सॉफ्टवेयर के साथ ही निष्पादित किया जा सकता है, क्रम में प्रयोग के दौरान प्रतिक्रिया कैनेटीक्स की भावना मिल. आगे के विश्लेषण से भी कई गतिज निशान औसत और बचत और अन्य डेटा विश्लेषण रेखांकन / सॉफ्टवेयर के लिए औसतन फ़ाइल निर्यात के द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है.

4. Msh2 Msh6 डीएनए बाध्यकारी कैनेटीक्स के लिए प्रतिनिधि परिणाम

Msh2 - Msh6 जी के साथ बातचीत के लिए काइनेटिक डेटा: टी बेमेल डीएनए, एक एकल घातीय समारोह के लिए फिट हो सकता है है और 3 करने के लिए करीब पर एक तेजी से बाध्यकारी दर लगातार कश्मीर उपज x 10 7 एम 1second 1 (4A छवि) और एक धीमी टी बेमेल तेजी से और 60 13 सेकंड के लिए करीब एक आधा जीवन के साथ एक बहुत ही स्थिर जटिल रूपों: पृथक्करण 0.012 दूसरा (4B छवि) -1, जो पता चलता है कि Msh2 Msh6 जी बांध के लगातार ऑफ कश्मीर.

Msh2 - Msh6 ATPase कैनेटीक्स के बी मापन

1. Msh2 Msh6 ATPase कैनेटीक्स प्रयोग के लिए नमूना तैयार

  1. Msh2 Msh6 तैयार और डीएनए अभिकर्मकों के रूप में पहले वर्णित है, unlabeled डीएनए का उपयोग कर. इसके अलावा, ई. से फास्फेट बाध्यकारी प्रोटीन (PBP) शुद्ध कोलाई और MDCC (छवि 5) fluorophore 14,15 के साथ लेबल . MDCC-PBP मुक्त फॉस्फेट तेजी से बांध (1 x 10 8 एम -1 -1 दूसरा बराबर होती है पर कश्मीर) और उच्च आत्मीयता (कश्मीर डी = 100 एनएम) के साथ, MDCC प्रतिदीप्ति (छवि 6) में एक नाटकीय वृद्धि में जिसके परिणामस्वरूप. MDCC PBP इसलिए पूर्व स्थिर राज्य एटीपी hydrolysis और फॉस्फेट रिलीज कैनेटीक्स 14,15 के एक मजबूत रिपोर्टर है. ध्यान दें कि यह पृष्ठभूमि इस परख के लिए फॉस्फेट स्तर को कम करने के लिए आवश्यक है, इसलिए, कांच के उपयोग को कड़ाई से अभिकर्मक की तैयारी के सभी चरणों में बचा जाना चाहिए.
  2. टी डीएनए, जो 1:01 मिश्रण अनुपात के साथ एक एकल मिश्रण का प्रयोग में पैदावार में 2 सुक्ष्ममापी और 3 अंतिम सांद्रता सुक्ष्ममापी: 4 Msh2 - Msh6 6 सुक्ष्ममापी जी के साथ या बिना प्रोटीन सुक्ष्ममापी के साथ एक नमूना तैयार. ध्यान दें कि पूर्व स्थिर राज्य प्रयोगों उच्च एंजाइम सांद्रता की आवश्यकता के बाद से ब्याज की संकेत एक एकल कारोबार या पहले कुछ उत्प्रेरक turnovers से है. एक और 1 हौसले से एटीपी और 20 सुक्ष्ममापी MDCC-PBP रिपोर्टर भंग मिमी युक्त नमूना तैयार. 0.10 मिलीग्राम / प्यूरीन न्यूक्लीओसाइड phosphorylase की और 200 नमूने, है जो किसी भी contaminating फॉस्फेट एमओपी कार्य करता है के लिए 7 methylguanosine सुक्ष्ममापी इकाइयों जोड़ें. बर्फ पर कम से कम 20 मिनट (तालिका 2) के लिए नमूने का सेते हैं.

2. Msh2 - Msh6 ATPase कैनेटीक्स के लिए साधन की तैयारी

  1. प्रयोगों के लिए बंद कर दिया प्रवाह साधन तैयार के रूप में पहले वर्णित है. इसके अलावा, 0.5 इकाइयों / एमएल प्यूरीन परमाणु साथ फॉस्फेट contaminant ड्राइव सीरिंज से चेहरे की विकृतिcleoside phosphorylase और 200 सुक्ष्ममापी 20 मिनट के लिए 7 - methylguanosine. 425 एनएम तरंगदैर्ध्य उत्तेजना सेट और MDCC-PBP प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए PMT के साथ एक 450 एनएम काट फिल्टर का उपयोग करें.

3. Msh2 - Msh6 ATPase प्रयोग और डेटा विश्लेषण

  1. जैसा कि पहले बताया नमूनों के साथ ड्राइव सीरिंज लोड. एटीपी और MDCC PBP और मॉनिटर फॉस्फेट रिलीज के साथ Msh2 - Msh6 और MDCC PBP प्रतिदीप्ति में समय के साथ युग्मित वृद्धि Msh2 - Msh6 मिश्रण करने के लिए डाटा एकत्रित करें पर क्लिक करें. कम से कम 5 गतिज निशान लीजिए एक उच्च गुणवत्ता वाले डेटा सेट प्राप्त करने के लिए और फ़ाइल सहेजें. औसत एकाधिक गतिज निशान और विश्लेषण के लिए डेटा फ़ाइल निर्यात.
  2. अंशांकन वक्र तैयार फॉस्फेट एकाग्रता और MDCC PBP प्रतिदीप्ति के बीच रैखिक संबंध का निर्धारण. आदेश में ऐसा करने के लिए बंद कर दिया प्रवाह में एक ही प्रयोगात्मक शर्तों के अधीन विभिन्न फॉस्फेट सांद्रता, और उपाय अधिकतम MDCC PBP प्रत्येक फॉस्फेट एकाग्रता में प्रतिदीप्ति के साथ MDCC PBP मिश्रण.
  3. अंशांकन वक्र (छवि 7) के लिए प्रत्येक फॉस्फेट एकाग्रता बनाम अधिकतम MDCC-PBP प्रतिदीप्ति प्लॉट और ढलान का उपयोग करने के लिए Msh2 - Msh6 प्रतिक्रियाओं में फॉस्फेट एकाग्रता प्राप्त है. प्लॉट समय बनाम फॉस्फेट एकाग्रता और एक घातीय और रैखिक समारोह के लिए डेटा फिट. इस समारोह में पूर्व स्थिर राज्य एटीपी hydrolysis और फॉस्फेट रिलीज रैखिक प्रतिक्रिया के स्थिर राज्य चरण द्वारा पीछा के एक फट वर्णन करता है.

4. Msh2 - Msh6 ATPase कैनेटीक्स के लिए प्रतिनिधि परिणाम

गतिज डेटा बताते हैं कि Msh2 - Msh6 hydrolyzes एटीपी और पहली उत्प्रेरक कारोबार में 1.4 दूसरी -1 विज्ञप्ति तेजी से फॉस्फेट. इस चरण प्रतिक्रिया है कि एक 7 गुना धीमी 0.2 दूसरा -1 (छवि 8A) के स्थिर राज्य कश्मीर बिल्ली बाद turnovers की सीमा में एक धीमी गति से कदम के द्वारा पीछा किया जाता है. हालांकि, जब Msh2 Msh6 बेमेल डीएनए, एटीपी hydrolysis और फॉस्फेट रिलीज के फट करने के लिए बाध्य है दबा है, और Msh2 - Msh6 एक एटीपी बाध्य राज्य में एक लंबे समय के लिए रहता है.

चित्रा 1
चित्रा 1 एस के शोधन. cerevisiae Msh2 Msh6 ई. से कोलाई. Msh2 और Msh6 जीन pET11a वेक्टर में क्लोन किया गया और ई. में व्यक्त BL21 (DE3) कोशिकाओं कोलाई. प्रोटीन जटिल कॉलम क्रोमैटोग्राफी द्वारा सपा sepharose, हेपरिन, और क्यू sepharose रेजिन से अधिक शुद्ध किया गया था. एसडीएस पृष्ठ यहाँ दिखाया विश्लेषण एक क्यू sepharose स्तंभ से भिन्न प्रोटीन होते हैं.

चित्रा 2
एक आसन्न (ATPase प्रयोगों के लिए) Adenosine या 2 Aminopurine Adenosine फ्लोरोसेंट बेस के अनुरूप है (डीएनए बाध्यकारी प्रयोगों के लिए) के साथ टी बेमेल: चित्रा 2 पूरक एकल असहाय DNAs जी युक्त द्वैध फार्म annealed रहे हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3 reactants के KinTek में फ्लो एक एकल मिश्रण का प्रयोग के दौरान प्रवाह बंद कर दिया.

चित्रा 4a
4a चित्रा Msh2 - Msh6 जी के साथ बातचीत के कैनेटीक्स: टी बेमेल. द्वैध डीएनए (0.12 सुक्ष्ममापी) जी युक्त मिश्रण: Msh2 - Msh6 (0.8 सुक्ष्ममापी) के साथ 2-Aminopurine निकट टी समय पर प्रतिदीप्ति में वृद्धि की ओर जाता है, और 2.4 = पर bimolecular दर लगातार 10 7 एम -1 एस कश्मीर पैदावार -1 बातचीत के लिए .

चित्रा 4b
4b चित्रा Msh2 - Msh6 जी के साथ बातचीत के कैनेटीक्स: टी बेमेल. मिश्रण पूर्व गठित Msh2 Msh6 जी टी (2 - एपी) अतिरिक्त unlabeled जी के साथ जटिल: टी डीएनए (8 सुक्ष्ममापी) है कि जाल किसी भी मुक्त Msh2 Msh6 समय पर प्रतिदीप्ति में कमी जाता है, और एक धीमी हदबंदी दर लगातार पैदावार, कश्मीर रवाना = 0.012 एस -1, ~ 60 सेकंड के एक लंबे आधे जीवन के साथ एक स्थिर परिसर का संकेत है. अंतिम सांद्रता 0.4 सुक्ष्ममापी Msh2 Msh6, 0.06 लेबल डीएनए सुक्ष्ममापी, 4 जी unlabeled सुक्ष्ममापी:: टी डीएनए जाल.

चित्रा 5
चित्रा 5 MDCC-PBP तैयारी. एसडीएस पृष्ठ ई. के विश्लेषण कोलाई फॉस्फेट बाध्यकारी प्रोटीन (PBP), और शुद्ध MDCC fluorophore के साथ लेबल.

चित्रा 6
चित्रा 6 MDCC PBP फॉस्फेट के लिए प्रतिक्रिया . MDCC-PBP की बढ़ती MDCC प्रतिदीप्ति में फॉस्फेट (Pi) के परिणामों के साथ टाइट्रेट करना.

चित्रा 7a
चित्रा 7a फॉस्फेट की तैयारी (Pi) मानक वक्र. एक - MDCC PBP (20 सुक्ष्ममापी) गड़बड़ी के अलग मात्रा (8 सुक्ष्ममापी 0) के साथ मिलाया जाता हैघ प्रतिदीप्ति समय पर मापा जब तक संतुलन तक पहुँच जाता है. - 4 सुक्ष्ममापी Pi 10 सुक्ष्ममापी MDCC PBP, 0: अंतिम सांद्रता.

चित्रा 7b
चित्रा 7b फॉस्फेट की तैयारी (Pi) मानक वक्र. अधिकतम MDCC PBP प्रतिदीप्ति प्लॉट बनाम [Pi] के लिए एक मानक वक्र उपज. लाइन (इस मामले में 0.383 -1 सुक्ष्ममापी) की ढलान Pi एकाग्रता में MDCC PBP प्रतिदीप्ति कन्वर्ट करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

चित्रा 8a
चित्रा 8a Msh2 - Msh6. ATPase कैनेटीक्स. (4 सुक्ष्ममापी) Msh2 - Msh6, अनुपस्थिति जी में: टी डीएनए, एटीपी (1 मिमी) और MDCC PBP (20 सुक्ष्ममापी) के साथ तेजी से मिश्रित एटीपी hydrolysis और Pi रिलीज के एक फट दर्शाती है. डेटा विश्लेषण (कश्मीर hydrolysis = 1.4 एस -1) दर और आयाम (2 सुक्ष्ममापी, Msh2 - Msh6 प्रति एक साइट) पैदावार फट चरण है, जो एक रेखीय, 0.4 सुक्ष्ममापी एस के दर पर स्थिर राज्य चरण द्वारा पीछा किया जाता है - (कश्मीर बिल्ली = 0.2 एस -1) 1.

चित्रा 8b
चित्रा 8b. Msh2 Msh6 ATPase कैनेटीक्स. जी के अतिरिक्त: टी प्रतिक्रिया करने के लिए डीएनए (6 सुक्ष्ममापी) एटीपी hydrolysis के फट को दबा, एक एटीपी बाध्य राज्य में जटिल स्थिर. 2 Msh2 Msh6 सुक्ष्ममापी, 500 सुक्ष्ममापी एटीपी, 3 सुक्ष्ममापी डीएनए, 10 PBP-सुक्ष्ममापी MDCC: अंतिम सांद्रता. फट कैनेटीक्स निम्न समीकरण द्वारा फिट हैं: Pi [] = एक 0 ई - कश्मीर टी + VT, जहां [अनुकरणीय] फॉस्फेट एकाग्रता 0 फट आयाम है, कश्मीर मनाया फट दर निरंतर है और वी के वेग है रैखिक चरण (कश्मीर बिल्ली = वी / [Msh2 Msh6]).

नमूना प्रोटीन डीएनए
अभिकर्मक स्टॉक कार्य वॉल्यूम, μL स्टॉक कार्य वॉल्यूम, μL
Msh2 - Msh6 5 सुक्ष्ममापी 0.8 सुक्ष्ममापी 64 - - -
2ApG: T - - - 10 सुक्ष्ममापी 0.12 सुक्ष्ममापी 4.8
बफर 10x 1x 40 10x 1x 40
DDH 2 हे - - 296 - - 355
कुल 400 400

टेबल 1 डीएनए बाध्यकारी प्रतिक्रिया

नमूना प्रोटीन प्रोटीन डीएनए एटीपी
अभिकर्मक स्टॉक कार्य वॉल्यूम, μL स्टॉक कार्य वॉल्यूम, μL स्टॉक कार्य वॉल्यूम, μL
Msh2 - Msh6 20 सुक्ष्ममापी 4 सुक्ष्ममापी 80 20 सुक्ष्ममापी 4 सुक्ष्ममापी 80 - - -
जी: टी - - - 100 6 24 - - -
एटीपी - - - - - - 50 मिमी 1 मिमी 8
7 - एमईजी 250x 1x 1.6 250x 1x 1.6 250x 1x 1.6
PNPase 100x 1x 4 100x 1x 4 100x 1x 4
PBP-MDCC 150 सुक्ष्ममापी 20 सुक्ष्ममापी 53.3 150 सुक्ष्ममापी 20 सुक्ष्ममापी 53.3 - - -
बफर 10x 1x 40 10x 1x 40 10x 1x 40
DDH 2 हे - - 221 - - 197 - - 346
कुल 400 400 400

तालिका 2 ATPase प्रतिक्रिया

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Discussion

उदाहरण के एक डीएनए बेमेल बाध्यकारी प्रोटीन यहाँ वर्णित की शक्ति और जैविक अणुओं के तंत्र के अध्ययन के लिए क्षणिक गतिज तरीकों की उपयोगिता दिखाता है. एकल कारोबार समय के पैमाने पर रूका प्रवाह माप एक बेमेल आधार जोड़ी और एक लंबे समय रहते 9 प्रतिक्रिया में प्रोटीन एक्स डीएनए जटिल के गठन करने के लिए तेजी से और विशिष्ट Msh2 - Msh6 प्रोटीन के बंधन के लिए स्पष्ट सबूत प्रदान की है. इसके अलावा, (और बुझाना प्रवाह) ATPase गतिविधि के बंद कर दिया प्रवाह बाध्यकारी बेमेल 11,16 डीएनए विश्लेषण के बाद एक एटीपी बाध्य रचना Msh2 - Msh6 स्विचन के लिए प्रत्यक्ष सबूत प्रदान. यह स्विच करने के लिए डीएनए की मरम्मत 17,18 संकेत धारणा है. पूरक उच्च संकल्प संरचनात्मक डेटा के साथ साथ इस तरह के उच्च संकल्प गतिज डेटा, macromolecular समारोह की समझ अग्रिम करने के लिए आवश्यक हैं.

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Acknowledgements

यह काम एक NSF कैरियर अवार्ड (MMH), बैरी एम. Goldwater छात्रवृत्ति (एफएनबी) और एक ASBMB अंडर ग्रेजुएट रिसर्च अवार्ड (CWD) द्वारा समर्थित किया गया था. PBP की अभिव्यक्ति के लिए क्लोन कृपया डॉ. मार्टिन वेब (MRC, ब्रिटेन) द्वारा प्रदान की गई थी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37 G DNA Sequence: 5’- ATT TCC TTC AGC AGA TAT G T A CCA TAC TGA TTC ACA T -3’
37 T (2-Ap) DNA Sequence: 5’- ATG TGA ATC AGT ATG GTA TApT ATC TGC TGA AGG AAA T -3’
37 T DNA Sequence: 5’- ATG TGA ATC AGT ATG GTA T A T ATC TGC TGA AGG AAA T -3’

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References

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