Die Anwendung der Stopped-Flow-Kinetics Methoden der Wirkmechanismus eines DNA-Repair Protein Untersuchen

Published 3/31/2010
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Biology

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Summary

MSH2-MSH6 ist verantwortlich für die Initiierung Reparatur der Replikation Fehler bei der DNA. Hier präsentieren wir eine transiente Kinetik Ansatz zum Verständnis, wie diese kritische Protein funktioniert. Der Bericht zeigt, stopped-flow Experimente zur Messung der gekoppelten DNA-Bindung und ATPase-Kinetik zugrunde liegenden MSH2-MSH6 Wirkmechanismus in der DNA-Reparatur.

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Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein. J. Vis. Exp. (37), e1874, doi:10.3791/1874 (2010).

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Abstract

Transient kinetische Analyse ist für das Verständnis der Funktionsweise von biologischen Makromolekülen unverzichtbar, da dieser Ansatz liefert mechanistische Informationen einschließlich der aktiven Seite Konzentrationen und intrinsischen Geschwindigkeitskonstanten, die makromolekulare Funktion zu regieren. Im Falle von Enzymen, z. B. zu identifizieren vorübergehend oder pre-steady state Messungen und Charakterisierung von einzelnen Veranstaltungen in den Reaktionsweg, während steady state Messungen nur Gesamtausbeute katalytische Effizienz und Spezifität. Einzelne Ereignisse wie Protein-Protein-oder Protein-Ligand-Wechselwirkungen und geschwindigkeitsbestimmenden Konformationsänderungen treten häufig in den Millisekundenbereich und kann direkt durch Stopped-Flow-und chemisch-Quench-Flow-Verfahren gemessen werden. Da ein optisches Signal, wie Fluoreszenz, stopped-flow dient als leistungsfähige und leicht zugängliche Tool zur Überwachung Reaktion Fortschritt von Substratbindung an Produkt-Release und katalytische Umsatz 1,2.

Hier berichten wir über Anwendung der Stopped-Flow-Kinetik der Wirkmechanismus von MSH2-MSH6, einer eukaryotischen DNA-Reparatur-Protein, das Basenpaar-Fehlpaarungen und Einfügen / Löschen Schleifen in DNA und Signale Mismatch-Reparatur (MMR) 3-5 erkennt Sonde. Dabei hilft MSH2-MSH6 erhöht die Genauigkeit der DNA-Replikation von drei Größenordnungen (Fehlerhäufigkeit sinkt von ~ 10 -6 bis 10 -9 Basen) und damit zu bewahren genomischen Integrität. Es überrascht nicht, ist defekt menschlichen MSH2-MSH6 Funktion mit hereditären nicht-polypösen Darmkrebs und anderen Krebsarten sporadisch 6-8 verbunden. Um den Wirkmechanismus dieser kritischen DNA metabolischen Protein zu verstehen, sind wir die Erforschung der Dynamik der MSH2-MSH6 Interaktion mit nicht übereinstimmenden DNA sowie die ATPase-Aktivität, die Kraftstoffe seine Aktionen in MMR. T mismatch und Überwachung der daraus resultierende Anstieg in 2-Amino-Fluoreszenz in Echtzeit: DNA-Bindung wird durch rasches Mischen MSH2-MSH6 mit DNA mit einem 2-Amino (2-Ap) Fluorophor benachbart zu einem G gemessen. T (2-Ap) Mismatch-Komplex mit unmarkierten Falle DNA und Überwachung Abnahme der Fluoreszenz im Laufe der Zeit 9: DNA Dissoziation wird durch Mischen von vorgeformten MSH2-MSH6 G gemessen. Pre-Steady-State-ATPase Kinetik werden durch die Veränderung der Fluoreszenz von 7-Diethylamino-3-((((2-maleimidyl) ethyl) amino) carbonyl) Cumarin)-markiertem Phosphat Binding Protein (MDCC-PBP) auf Bindung von Phosphat (gemessen Pi) von MSH2-MSH6 folgenden ATP-Hydrolyse 9,10 freigegeben.

Die Daten zeigen eine schnelle Bindung von MSH2-MSH6 eine G: T Mismatch und die Bildung eines langlebigen MSH2-MSH6 G: T-Komplex, was wiederum zu einer Unterdrückung der ATP-Hydrolyse und die Stabilisierung des Proteins in einem ATP-gebundenen Form . Die Reaktionskinetik klare Unterstützung für die Hypothese, dass ATP-gebundenen MSH2-MSH6 Signale DNA-Reparatur auf die Bindung einer unpassenden Basenpaar in der Doppelhelix.

F. Noah Biro und Jie Zhai trugen zu diesem Papier ebenso.

Protocol

A. Messung der MSH2-MSH6 DNA Binding Kinetics

1. Probenvorbereitung für die MSH2-MSH6 DNA Bindungskinetik Experiment

Vorbereitung der Reagenzien für einen Fluoreszenz-basierten kinetischen DNA-Bindung Experiment auf einer stopped-flow ist ähnlich wie bei einem Gleichgewicht Experiment auf einem Fluorometer. In der Tat Gleichgewicht verbindliche Analyse sollte zuerst durchgeführt werden, um die Dissoziationskonstante (K D) für die Interaktion zu schätzen, um Reaktionsbedingungen für kinetische Analysen zu optimieren. Stopped-Flow-Experimente erfordern größere Mengen an biologischen Materialien im Vergleich mit Gleichgewichts-oder steady-state Experimente, daher ist der Ansatz am ehesten machbar, wenn niedrige Milligramm-Mengen an Protein zur Verfügung stehen 11,12 und ähnliche Mengen an Liganden können hergestellt oder gekauft werden.

  1. Wir über-express S. cerevisiae MSH2-MSH6 in E. coli und Reinigung von Milligramm-Mengen des Proteins durch Ionenaustausch-Chromatographie (Abb. 1) 11.
  2. DNA-Reagenzien mit oder ohne die 2-Amino-Fluorophor kann chemisch synthetisiert werden. Wir Kaufen Sie 37 Nukleotid lange einzelsträngige DNAs mit 2-Amino modifiziert und Glühen zwei komplementäre Stränge zu Duplex-DNA mit 2-Aminopurin neben einem G vorzubereiten: T mismatch (Abb. 2). DNA kann durch den Hersteller oder im Labor durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt werden, wobei letztere in der Regel ergibt höhere Ausbeuten.
  3. Für die DNA-Bindungskinetik bereiten separaten G: T (2-Ap) DNA und MSH2-MSH6 Proteinproben in DNA-Bindungspuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM MgCl 2, 100 mM NaCl). MSH2-MSH6 und DNA-Konzentrationen sind 0,8 um und 0,12 um jeweils die 0,4 uM und 0,06 uM Endkonzentration liefert in einem einzigen Experiment Mischen mit 1:1 Mischungsverhältnis. Für die DNA-Dissoziationskinetik, bereiten eine Probe mit 0,8 uM MSH2-MSH6 und 0,12 uM G: T (2-Ap) DNA, und eine andere Probe mit 8 uM unmarkiertem G: T-DNA als eine Falle für freie MSH2-MSH6. Bereiten Sie und speichern Sie die Proben auf Eis. In diesen Reaktionen wird Proteinkonzentration deutlich über dem 10 nM K D für MSH2-MSH6-DNA-Interaktion und DNA-Konzentration ist ausreichend für eine robuste Fluoreszenzsignal (empirisch ermittelt). Ein Volumen von 400 ul pro Probe ist ausreichend, um ca. 10 kinetische Spuren (Tabelle 1) zu erhalten.
  4. Verwenden Sie qualitativ hochwertige Chemikalien, die frei von fluoreszierenden Verunreinigungen in der Protein-, DNA und Puffer-Präparate. Filter alle Puffer durch einen 0,2 um Membran zu vermeiden Verstopfung der stopped-flow mit Partikeln.
  5. Wenn das Fluorophor absorbiert sichtbares Licht, die Vorbereitung und Experiment muss unter schlechten Lichtverhältnissen durchgeführt werden.

2. Instrument Vorbereitung auf das MSH2-MSH6 DNA-Bindungskinetik

Ein stopped-flow Instrument ist recht einfach im Prinzip. Es verwendet einen Antriebsmotor schnell push zwei Lösungen in der Antriebstechnik Spritzen in einer Mischvorrichtung, die gemischte Lösung fließt dann in eine Beobachtung Zelle für die Datenerfassung (Abb. 3). Wir nutzen die KinTek stopped-flow, der niedrige Probenvolumen erfordert, lassen sich einzelne oder sequentielle Mischen der Reaktanten, Detektion einer Vielzahl von optischen Signalen, und ist sehr einfach zu bedienen. Stopped-Flow-Instrumente sind aus verschiedenen anderen Herstellern ebenfalls zur Verfügung.

  1. Um die Stopped-Flow-Gerät für Experimente vorbereiten, stellen Sie sicher, den Computer und Controller ausgeschaltet sind. Schalten Sie den zirkulierenden Wasserbad setzen auf Raumtemperatur (25 °, C), um die Lampe zu kühlen. Schalten Sie die Lampe. Setzen Sie den Monochromator auf die gewünschte Anregungswellenlänge (315 nm im Falle von 2-Amino). Drehen Sie den Schlitz Lenkrad in die gewünschte Spaltbreite (empirisch Gleichgewicht hohen Fluorophor Anregung mit niedrigen Bleichen). Schalten Sie den Controller und dem Computer. Schalten Sie den zirkulierenden Wasserbad auf dem Wassermantel, dass die Reaktanten hält bei einer gewünschten Temperatur während des Experiments (30 ° C im Falle von S. cerevisiae MSH2-MSH6) zu füllen.
  2. Als nächstes führen Sie den stopped-flow-Programm. Schalten Sie den Detektor der Wahl, die in diesem Fall ist ein Photomultiplier (PMT) mit einem Interferenzfilter geeignet für das Fluorophor (350 nm cut-off-Filter im Falle von 2-Amino). Spannung an der PMT. Messen Sie den Dunkelstrom für jeden Hintergrund elektrisches Rauschen zu korrigieren.
  3. Die stopped-flow-Laufwerk Spritzen und Beobachtung Zelle muss vor dem Laden der Proben gewaschen werden. Stellen Sie die Probe Loading Ventil der LOAD Position. Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit entionisiertem, gefiltertem Wasser, hängen Sie es an den Verladehafen unter dem Antrieb Spritze entfernt und manuell schieben Wasser zwischen den beiden Spritzen ein paar mal. Wiederholen Sie den Vorgang zweimal für jedes Laufwerk Spritze in das Experiment eingesetzt werden. Anschließend füllen Sie das Laufwerk Spritzen mit Wasser auf die Beobachtung Zelle zu waschen. Schalten Sie das Beispiel Loading Ventil in die Fire Position. Verwenden Sie den Adjust SpritzenantriebBefehl, der den Antriebsmotor, und senken Sie die Antriebsscheibe, um Wasser durch die Beobachtung Zelle und in der Abfahrt Linie schieben steuert. Achten Sie darauf, den Kolben bis zum Ende des Antriebs Spritze schieben. Heben Sie die Mitnehmerscheibe. Schalten Sie das Ventil in die LOAD Position. Manuelles Waschen Sie die Spritzen mit dem Reaktionspuffer und leer. Das Gerät ist jetzt einsatzbereit.

3. MSH2-MSH6 DNA-Bindung Experiment und Datenanalyse

  1. Übertragen Sie jede Probe aus dem Rohr zu einer frischen 1 ml Spritze. Befestigen Sie jede Probe Spritze zu einer Be-Port und drücken Sie die Lösung in das Laufwerk Spritze. Achten Sie darauf, alle Luftblasen durch manuelles Drücken der Lösung zwischen den beiden Spritzen ein paar Mal mit intermittierenden Pausen zu entfernen. Senken Sie die Antriebsscheibe, bis sie die Oberseite der Festplatte Spritzen. Lassen Sie die Reaktionspartner auf Raumtemperatur äquilibrieren für ein paar Minuten.
  2. Für die Datenerhebung, öffnen Sie das Set Time / Channels-Fenster, wählen Sie die Datenerfassung Kanal (PMT), die Art der Daten-Analyse (Fluorescence), und die Anzahl der Spuren (Shots) gesammelt werden. Geben Sie die Datensammlung Zeit, in der 1000 Datenpunkte gesammelt werden. Eine unbekannte Reaktion sollte über mehrere Sekunden überwacht werden, um etwaige langsame Phasen zu erkennen. Empirisch schätzen den Zeitaufwand für die Gleichgewichts-oder stationären und setzen Datensammlung Zeit ≥ 6 Halbwertszeiten erreichen. Im Falle der MSH2-MSH6 die optimale Zeitrahmen beträgt 2 Sekunden für G: T mismatch Bindungskinetik und 60 Sekunden für G: T Dissoziationskinetik. Jetzt stellen Sie das Ventil in die Fire Position und klicken Sie auf das Sammeln von Daten-Taste. Diese Aktion löst Vermischung von MSH2-MSH6 und DNA, Eintritt der Reaktion in der Beobachtung, Zelle, Anregung des 2-Amino-Fluorophor und Sammlung des Fluoreszenzsignals im Laufe der Zeit. Sammeln Sie mindestens 5 kinetische Spuren, qualitativ hochwertige Daten zu erhalten und speichern Sie die Datei.
  3. Wenn das Experiment beendet ist, der die Lampe einzuschalten. Waschen Sie die Spritzen und Beobachtung Zelle mit Wasser wie zuvor beschrieben. Schalten Sie dann den Rest der Ausrüstung, mit Ausnahme der zirkulierenden Wasserbad. Das Wasser wird für weitere 15 Minuten, um die Lampe zu kühlen zirkuliert.
  4. Mathematische Operationen und Daten Montage kann mit dem KinTek Software selbst durchgeführt werden, um ein Gefühl für die Reaktionskinetik während des Experiments zu bekommen. Weitere Analysen können auch durch Mittelung mehrere kinetische Spuren und Speichern und Exportieren der gemittelten Datei an andere Datenanalyse / Grafik-Software durchgeführt werden.

4. Repräsentative Ergebnisse für MSH2-MSH6 DNA Bindungskinetik

Kinetische Daten für MSH2-MSH6 Interaktionen mit G: T Mismatch DNA, kann auf eine einzelne Exponentialfunktion angepasst werden und ergeben eine schnelle verbindliche Geschwindigkeitskonstante k ON in der Nähe von 3 x 10 7 M-1 Sekunden-1 (Abb. 4A) und eine langsame Dissoziationskonstante k OFF von 0,012 Sekunden -1 (Abb. 4B), so dass der MSH2-MSH6 G bindet zeigt: T mismatch schnell und bildet einen sehr stabilen Komplex mit einer Halbwertszeit in der Nähe von 60 Sekunden 13.

B. Messung der MSH2-MSH6 ATPase Kinetics

1. Probenvorbereitung für die MSH2-MSH6 ATPase Kinetik Experiment

  1. Bereiten MSH2-MSH6 und DNA Reagenzien wie oben beschrieben, mit unmarkierter DNA. Darüber hinaus reinigen Phosphate Binding Protein (PBP) aus E. coli und beschriften Sie sie mit der MDCC Fluorophor (Abb. 5) 14,15. MDCC-PBP bindet freies Phosphat schnell (k ON gleich 1 x 10 8 M -1 Sekunde -1) und mit hoher Affinität (K D = 100 nM), was zu einem dramatischen Anstieg der MDCC-Fluoreszenz (Abb. 6). MDCC-PBP ist somit eine robuste Reporter der pre-steady state ATP-Hydrolyse-und Phosphat-Freisetzungskinetik 14,15. Beachten Sie, dass es unerlässlich ist, Hintergrund-Phosphat-Spiegel für diesen Test zu minimieren, daher die Verwendung von Glas sollten strikt auf allen Stufen der Aufbereitung des Reagenz zu vermeiden.
  2. Bereiten Sie eine Probe mit 4 uM MSH2-MSH6 Protein mit oder ohne 6 uM G: T-DNA, die 2 um und 3 um Endkonzentrationen liefert in einem einzigen Experiment Mischen mit 1:1 Mischungsverhältnis. Beachten Sie, dass pre-steady state Experimente hohen Enzym-Konzentrationen erforderlich, da das Signal von Interesse ist aus einem einzigen Umsatz oder den ersten Umsätzen. Bereiten Sie eine andere Probe mit 1 mM frisch gelöst ATP und 20 uM MDCC-PBP Reporter. Add 0,10 Einheiten / ml Purinnucleosidphosphorylase und 200 uM 7-Methylguanosin zu den Proben, die zu wischen Sie kontaminieren Phosphat dient. Inkubieren Sie die Proben auf Eis für mindestens 20 Minuten (Tabelle 2).

2. Instrument Vorbereitung auf das MSH2-MSH6 ATPase Kinetik

  1. Bereiten Sie die Stopped-Flow-Gerät für Experimente wie oben beschrieben. Darüber hinaus aufwischen Phosphat Verunreinigungen aus dem Laufwerk Fertigspritzen mit 0,5 Einheiten / ml Purin nucleoside Phosphorylase und 200 uM 7-Methylguanosin für 20 Minuten. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 425 nm und mit einem 450 nm cut-off-Filter mit der PMT für den Nachweis von MDCC-PBP Fluoreszenz.

3. MSH2-MSH6 ATPase Experiment und Datenanalyse

  1. Legen Sie das Laufwerk Spritzen mit den Proben, wie oben beschrieben. Klicken Sie auf Daten sammeln, um MSH2-MSH6 mit ATP und MDCC-PBP und überwachen Phosphatfreisetzung Mix von MSH2-MSH6 und die gekoppelte Erhöhung der MDCC-PBP Fluoreszenz über die Zeit. Sammeln Sie mindestens 5 kinetische Spuren zu einer qualitativ hochwertigen Datensatz erhalten und speichern Sie die Datei. Durchschnittliche mehrere kinetische Spuren und exportieren Sie die Daten-Datei für die Analyse.
  2. Bereiten Sie eine Eichkurve auf der linearen Beziehung zwischen Phosphat-Konzentration und MDCC-PBP Fluoreszenz zu bestimmen. Um dies zu tun, mischen MDCC-PBP mit verschiedenen Phosphatkonzentrationen unter den gleichen Versuchsbedingungen im stopped-flow, und messen maximal MDCC-PBP Fluoreszenz bei jedem Phosphatkonzentration.
  3. Plot der maximalen MDCC-PBP Fluoreszenz gegen jede Phosphatkonzentration für die Eichkurve (Abb. 7) und die Neigung zu Phosphat-Konzentration in der MSH2-MSH6 Reaktionen zu erhalten. Plot-Phosphat-Konzentration gegen die Zeit und passen die Daten zu einem exponentiellen und linearen Funktion. Diese Funktion beschreibt einen Ausbruch von pre-steady state ATP-Hydrolyse-und Phosphat-Freisetzung durch die lineare steady state Phase der Reaktion gefolgt.

4. Repräsentative Ergebnisse für MSH2-MSH6 ATPase Kinetik

Die kinetischen Daten zeigen, dass MSH2-MSH6 hydrolysiert ATP und Phosphat freisetzt schnell bei 1,4 Sekunden -1 in der ersten katalytischen Umsatz. Diese Phase ist durch einen langsamen Schritt der Reaktion, dass nachfolgende Umsätze Grenzen zu einem 7-fach langsamer steady state k cat von 0,2 Sekunden -1 (Abb. 8A) gefolgt. Allerdings ist beim MSH2-MSH6 ist nicht übereinstimmende DNA, dem Platzen der ATP-Hydrolyse-und Phosphat-Freisetzung gebunden unterdrückt und MSH2-MSH6 bleibt in einem ATP-gebundenen Zustand für eine längere Zeit.

Abbildung 1
Abbildung 1. Reinigung von S. cerevisiae MSH2-MSH6 von E. coli. MSH2 und MSH6 Gene wurden in pET11a kloniert und in E. überexprimiert coli BL21 (DE3)-Zellen. Die Protein-Komplex wurde durch Säulenchromatographie über SP-Sepharose, Heparin und Q-Sepharose Harze gereinigt. SDS-PAGE-Analyse gezeigt, enthält hier Proteinfraktionen aus einer Q-Sepharose-Säule.

Abbildung 2
. Abbildung 2 komplementären Einzelstrang-DNAs sind geglüht, um eine Duplex mit G Form: T mismatch mit einem benachbarten Adenosin (für ATPase-Experimente) oder 2-Aminopurin fluoreszierenden Basis analog von Adenosin (für DNA-Bindung Experimente).

Abbildung 3
Abbildung 3. Flow of Reaktanden in der KinTek stopped-flow während eines einzigen Mischen Experiment.

Abbildung 4a
Abbildung 4a Kinetik der MSH2-MSH6 Interaktion mit einem G:. T mismatch. Das Mischen von Duplex-DNA (0,12 pM) mit einem G: T angrenzend an 2-Amino mit MSH2-MSH6 (0,8 M) führt zu der Fluoreszenz im Laufe der Zeit zu erhöhen, und ergibt eine bimolekulare Geschwindigkeitskonstante k ON = 2,4 10 7 M -1 s -1 für die Interaktion.

Abbildung 4b
Abbildung 4b Kinetik der MSH2-MSH6 Interaktion mit einem G:. T mismatch. Mixing vorgeformte MSH2-MSH6 G: T (2-Ap)-Komplex mit einem Überschuss an unmarkiertem G: T-DNA (8 M), die Fallen jede freie MSH2-MSH6 führt zu der Fluoreszenz im Laufe der Zeit abnimmt, und ergibt eine langsame Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante, k OFF = 0,012 s -1, was auf einen stabilen Komplex mit einer langen Halbwertzeit von ca. 60 Sekunden. Endkonzentrationen: 0,4 uM MSH2-MSH6, 0,06 pM markierter DNA, 4 uM unmarkiertem G: T-DNA-Trap.

Abbildung 5
Abbildung 5. MDCC-PBP Vorbereitung. SDS-PAGE-Analyse von E. coli Phosphat-bindenden Proteins (PBP), gereinigt und gekennzeichnet mit dem MDCC Fluorophor.

Abbildung 6
Abbildung 6. MDCC-PBP Reaktion auf Phosphat. Titration von MDCC-PBP mit Phosphat (Pi) führt zu einer zunehmenden MDCC Fluoreszenz.

Abbildung 7a
Abbildung 7a. Vorbereitung des Phosphat (Pi) Standardkurve. An - MDCC-PBP (20 nM) mit unterschiedlichen Mengen Pi (8 uM 0) gemischtd Fluoreszenz gemessen im Laufe der Zeit, bis das Gleichgewicht erreicht ist. Endkonzentrationen: 10 uM MDCC-PBP, 0 bis 4 uM Pi.

Abbildung 7b
Abbildung 7b. Vorbereitung des Phosphat (Pi) Standardkurve. Maximale MDCC-PBP Fluoreszenz aufgetragen gegen [Pi], um eine Standardkurve zu erhalten. Die Neigung der Linie (0,383 uM -1 in diesem Fall) wird verwendet, um MDCC-PBP Fluoreszenz in Pi-Konzentration umzuwandeln.

Abbildung 8a
Abbildung 8a. MSH2-MSH6 ATPase Kinetik. MSH2-MSH6 (4 M) in Abwesenheit G: T-DNA, schnell mit ATP (1 mM) und MDCC-PBP (20 nM) gemischt weist ein Platzen der ATP-Hydrolyse und Pi freizugeben. Die Datenanalyse ergibt sich die Geschwindigkeit (k Hydrolyse = 1,4 s -1) und Amplitude (2 uM, 1 Seite pro MSH2-MSH6) der Burst-Phase, die durch eine lineare, steady state-Phase mit einer Rate von 0,4 uM s gefolgt ist - 1 (k cat = 0,2 s -1).

Abbildung 8b
Abbildung 8b. MSH2-MSH6 ATPase Kinetik. Die Zugabe von G: T-DNA, um die Reaktion (6 M) unterdrückt das Platzen der ATP-Hydrolyse, die Stabilisierung des Komplexes in einem ATP-gebundenen Zustand. Endkonzentrationen: 2 uM MSH2-MSH6, 500 uM ATP, 3 uM DNA, 10 pM MDCC-PBP. Burst Kinetik werden durch die folgende Gleichung passen: [Pi] = A 0 e-k t + Vt, wobei [Pi] ist Phosphatkonzentration, A 0 ist die Burst-Amplitude, k die beobachtete Burst-Rate konstant und V ist die Geschwindigkeit des der linearen Phase (k cat = V / [MSH2-MSH6]).

Probe Protein DNA
Reagens Lager Arbeiten Vol, ul Lager Arbeiten Vol, ul
MSH2-MSH6 5 uM 0,8 um 64 - - -
2ApG: T - - - 10 uM 0,12 um 4,8
Puffer 10x 1x 40 10x 1x 40
ddH 2 O - - 296 - - 355
Gesamt 400 400

Tabelle 1 DNA-Bindungsreaktion

Probe Protein Protein-DNA ATP
Reagens Lager Arbeiten Vol, ul Lager Arbeiten Vol, ul Lager Arbeiten Vol, ul
MSH2-MSH6 20 uM 4 uM 80 20 uM 4 uM 80 - - -
G: T - - - 100 6 24 - - -
ATP - - - - - - 50 mM 1 mM 8
7-MEG 250x 1x 1,6 250x 1x 1,6 250x 1x 1,6
PNPase 100x 1x 4 100x 1x 4 100x 1x 4
PBP-MDCC 150 uM 20 uM 53,3 150 uM 20 uM 53,3 - - -
Puffer 10x 1x 40 10x 1x 40 10x 1x 40
ddH 2 O - - 221 - - 197 - - 346
Gesamt 400 400 400

Tabelle 2 ATPase Reaktion

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Discussion

Das Beispiel eines DNA-Mismatch-binding protein hier beschriebenen veranschaulicht die Leistungsfähigkeit und den Nutzen von transient kinetische Methoden zur Erforschung der Mechanismen von biologischen Molekülen. Stopped-Flow-Messungen an den einzelnen Umsatz Zeitskala der eindeutige Beweis für eine schnelle und spezifische Bindung von MSH2-MSH6 Protein zu einem übereinstimmenden Basenpaar und die Bildung eines langlebigen Protein X DNA-Komplex in der Reaktion 9. Des Weiteren hat die Stopped-Flow-(und Quench-Flow-) Analyse der ATPase-Aktivität direkten Beweis für MSH2-MSH6 Wechsel zu einem ATP-gebundenen Konformation nach Bindung übereinstimmende DNA 11,16. Dieser Schalter wird angenommen, dass die DNA-Reparatur 17,18 Signal. Solche hochauflösenden kinetische Daten, zusammen mit ergänzenden hochauflösenden Strukturdaten sind wesentlich für das Verständnis von makromolekularen Funktion voraus.

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Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch einen NSF CAREER Award (MMH), ein Barry M. Goldwater Stipendium (FNB) und eine ASBMB Undergraduate Research Award (CWD) unterstützt. Der Klon für die Überexpression von PBP wurde freundlicherweise von Dr. Martin Webb (MRC, UK) zur Verfügung gestellt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37 G DNA Sequence: 5’- ATT TCC TTC AGC AGA TAT G T A CCA TAC TGA TTC ACA T -3’
37 T (2-Ap) DNA Sequence: 5’- ATG TGA ATC AGT ATG GTA TApT ATC TGC TGA AGG AAA T -3’
37 T DNA Sequence: 5’- ATG TGA ATC AGT ATG GTA T A T ATC TGC TGA AGG AAA T -3’

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References

  1. Johnson, K. A. Advances in transient-state kinetics. Curr Opin Biotechnol. 9, (1), 87-89 (1998).
  2. Johnson, K. A. E. Kinetic analysis of macromolecules. Oxford University Press. (2003).
  3. Obmolova, G., Ban, C., Hsieh, P., Yang, W. Crystal structures of mismatch repair protein MutS and its complex with a substrate DNA. Nature. 407, (6805), 703-710 (2000).
  4. Lamers, M. H. The crystal structure of DNA mismatch repair protein MutS binding to a G x T mismatch. Nature. 407, (6805), 711-717 (2000).
  5. Warren, J. J. Structure of the human MutSalpha DNA lesion recognition complex. Mol Cell. 26, (4), 579-592 (2007).
  6. Kunkel, T. A. &, Erie, D. A. DNA Mismatch Repair. Annu Rev Biochem. 74, 681-710 (2005).
  7. Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, (5), 335-346 (2006).
  8. Hsieh, P., Yamane, K. DNA mismatch repair: Molecular mechanism, cancer, and ageing. Mech Ageing Dev. 129, (7-8), 391-407 (2008).
  9. Jacobs-Palmer, E., Hingorani, M. M. The effects of nucleotides on MutS-DNA binding kinetics clarify the role of MutS ATPase activity in mismatch repair. J Mol Biol. 366, (4), 1087-1098 (2007).
  10. Antony, E., Khubchandani, S., Chen, S., Hingorani, M. M., M, M. Contribution of Msh2 and Msh6 subunits to the asymmetric ATPase and DNA mismatch binding activities of Saccharomyces cerevisiae Msh2-Msh6 mismatch repair protein. DNA Repair (Amst). 5, (2), 153-162 (2006).
  11. Antony, E., Hingorani, M. M. Mismatch recognition-coupled stabilization of Msh2-Msh6 in an ATP-bound state at the initiation of DNA repair. Biochemistry. 42, (25), 7682-7693 (2003).
  12. Finkelstein, J., Antony, E., Hingorani, M. M., O'Donnell, M. Overproduction and analysis of eukaryotic multiprotein complexes in Escherichia coli using a dual-vector strategy. Anal Biochem. 319, (1), 78-87 (2003).
  13. Zhai, J., Hingorani, M. M. S. cerevisiae Msh2-Msh6 DNA binding kinetics reveal a mechanism of targeting sites for DNA mismatch repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (2), 680-685 (2010).
  14. Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Webb, M. R. Direct, real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33, (27), 8262-8271 (1994).
  15. Brune, M. Mechanism of inorganic phosphate interaction with phosphate binding protein from Escherichia coli. Biochemistry. 37, (29), 10370-10380 (1998).
  16. Antony, E., Hingorani, M. M. Asymmetric ATP binding and hydrolysis activity of the Thermus aquaticus MutS dimer is key to modulation of its interactions with mismatched DNA. Biochemistry. 43, (41), 13115-13128 (2004).
  17. Gradia, S., Acharya, S., Fishel, R. The human mismatch recognition complex hMSH2-hMSH6 functions as a novel molecular switch. Cell. 91, (7), 995-1005 (1997).
  18. Mazur, D. J., Mendillo, M. L., Kolodner, R. D., D, R. Inhibition of Msh6 ATPase activity by mispaired DNA induces a Msh2(ATP)-Msh6(ATP) state capable of hydrolysis-independent movement along DNA. Mol Cell. 22, (1), 39-49 (2006).

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