DNA Onarım Protein Eylem Mekanizması Soruşturma Durduruldu akış Kinetiği Yöntemleri Uygulama

Published 3/31/2010
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Msh2 Msh6 DNA replikasyon hataları tamir başlatmak için sorumludur. İşte bu kritik protein nasıl çalıştığını anlamak yolunda geçici bir kinetiği yaklaşım sunuyoruz. Rapor durdu akış birleştiğinde DNA bağlayıcı ve eylem Msh2-Msh6 DNA onarım mekanizması altında yatan ATPaz kinetiği ölçmek için deneyler göstermektedir.

Cite this Article

Copy Citation

Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein. J. Vis. Exp. (37), e1874, doi:10.3791/1874 (2010).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bu yaklaşımın mekanistik bilgi makromoleküler fonksiyonu yöneten etkin sitenin konsantrasyonları ve içsel hız sabitleri dahil verimleri beri Geçici kinetik analizi, biyolojik makromoleküllerin işleyişini anlamak için vazgeçilmez bir unsurdur. Kararlı durum ölçümleri, sadece genel katalitik verimliliği ve özgünlüğü verimi ise, enzimler durumda, örneğin, geçici ya da önceden istikrarlı bir devlet ölçümleri tanımlamak ve reaksiyon yolu bireysel olayları karakterize. Bireysel, protein-protein ya da protein-ligand etkileşimleri ve hız sınırlayıcı yapı değişiklikleri gibi olaylar sık ​​sık milisaniyelik zaman ölçeğinde meydana gelen ve durdu akışı ve kimyasal quench akış yöntemleri ile doğrudan ölçülebilir. Gibi floresan gibi bir optik sinyal durdu akış ürün sürümü ve katalitik cirosu 1,2 bağlayıcı substrat izleme tepki ilerleme için güçlü ve ulaşılabilir bir araç olarak hizmet vermektedir .

Burada, durdu akış kinetiği uygulama Msh2-Msh6 etki mekanizması, baz çifti uyumsuzlukları ve DNA ve sinyalleri uyumsuzluğu onarım (MMR) 3-5 ekleme / silme döngüleri tanıyan bir ökaryotik DNA onarım protein prob rapor. Bunu yaparken, böylece Msh2 Msh6 büyüklükte üç siparişleri (~ 10 -6 to10 -9 üsleri hata sıklığı azalır) DNA replikasyonu doğruluğunu artırır ve genomik bütünlüğünü korumaya yardımcı olur . Beklendiği gibi, insan kusurlu Msh2-Msh6 fonksiyonu kalıtsal non-polipozis kolon kanseri ve diğer sporadik kanserler 6-8 ile ilişkilidir. Bu kritik DNA metabolik protein eylem mekanizmasını anlamak için, eşleşmeyen DNA gibi ATPaz aktivitesi Msh2 Msh6 etkileşim dinamikleri problama yakıtlar MMR olarak eylemler. T uyumsuzluğu ve izleme, gerçek zamanlı olarak 2-aminopurine floresan ortaya çıkan artış: DNA bağlayıcı G bitişik 2-aminopurine (2-Ap) fluorofor içeren DNA ile hızla Msh2-Msh6 karıştırma ile ölçülür. T (2-Ap) etiketsiz tuzak DNA ve izleme süresi 9 üzerinde floresan azalma ile uyumsuzluğu kompleksi: DNA disosiasyon önceden oluşmuş Msh2-Msh6 G karıştırılarak ölçülür. Pre-kararlı durum ATPaz kinetiği 7-diethylamino-3-((((2-maleimidyl) etil) amino) karbonil) kumarin) etiketli bağlayıcı fosfat Fosfat Bağlayıcı Protein (MDCC-PBP) (floresan değişimi ile ölçülür Pi) ATP hidrolizi 9,10 Msh2-Msh6 tarafından yayınlandı.

T uyumsuzluğu ve oluşumu uzun ömürlü bir Msh2-Msh6 G: Bu veriler G Msh2-Msh6 hızlı bağlanma ortaya T kompleksi bağlı bir ATP şeklinde proteinin ATP hidroliz ve istikrar baskılanması teslim sonuçları . Reaksiyon kinetiği hipotez için açık destek sağlayan ATP bağlı Msh2 Msh6 sinyaller uyumsuz bir baz çifti bağlayıcı çift sarmal DNA onarım.

F. Nuh Biro ve Jie Zhai Bu çalışmada eşit katkıda bulunmuştur.

Protocol

Msh2 Msh6 DNA Cilt Kinetiği A. Ölçüm

1. Msh2-Msh6 DNA bağlayıcı kinetik deney için numune hazırlama

Durdurulmuş bir akış bir floresans tabanlı kinetik DNA bağlayıcı deney için reaktiflerin hazırlanması, bir flüorometre bir denge deney için benzer. Aslında denge bağlayıcı analizi, kinetik analizi için reaksiyon koşulları optimize etmek için etkileşim için ayrışma sabiti (K D) tahmin etmek için ilk olarak yapılmalıdır. Durduruldu akış deneyleri denge ya da kararlı durum deneyler ile karşılaştırıldığında, biyolojik malzemelerin büyük miktarlarda gerektirir; düşük miligram miktarda protein 11,12 mevcuttur ve benzer miktarda ligandlar hazırlanmış veya satın alınabilir, bu nedenle, bu yaklaşım en uygun.

  1. Biz fazla ifade S. cerevisiae E. Msh2-Msh6 coli ve iyon değişim kromatografisi (Şekil 1) 11 protein saflaştırmak miligram miktarlarda.
  2. Veya 2-Aminopurine fluorofor DNA reaktiflerin kimyasal olarak sentezlenmiş olabilir. Biz 2 Aminopurine ile değiştirilen 37 nükleotid uzunluğunda tek zincirli DNA'lar satın alan ve G bitişik 2-Aminopurine dubleks DNA hazırlamak için iki tamamlayıcı ipliklerini tavlama: T uyumsuzluğu (Şekil 2). DNA denatüre poliakrilamid jel elektroforezi, üretici tarafından veya laboratuarda saflaştırılmış, ikincisi genellikle daha yüksek verim verir.
  3. : DNA bağlanma kinetiği için, ayrı G hazırlamak T (2-Ap) DNA ve DNA bağlayıcı tampon Msh2-Msh6 protein örneklerinin (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5 mM MgCl 2, 100 mM NaCl). Msh2-Msh6 ve DNA konsantrasyonları 01:01 karışım oranı ile tek bir karıştırma deneyde, 0.4 mcM ve 0.06 mcM son konsantrasyonları verimleri, sırasıyla 0.8 mcM ve 0.12 mcM. T (2-Ap) DNA ve 8 mcM etiketsiz G ile başka bir örnek: DNA disosiasyon kinetik için 0.8 mcM Msh2-Msh6 ve 0.12 mcM G içeren bir örnek hazırlamak T DNA ücretsiz Msh2-Msh6 için bir tuzak olarak. Hazırlayın ve buz örnekleri saklamak. Bu reaksiyonlar, protein konsantrasyonu (ampirik belirlenen) sağlam bir floresan sinyali için yeterli Msh2-Msh6-DNA etkileşimi ve DNA konsantrasyonu 10 nM K D üzerindedir. Numune başına 400 ul hacmi yaklaşık 10 kinetik izleri (Tablo 1) elde etmek için yeterli.
  4. Floresan protein, DNA ve tampon hazırlıkları kirliliklerin ücretsiz yüksek kaliteli kimyasal maddeler kullanmayın. Partiküller ile durdu-akış tıkanmayı önlemek için 0.2 mikron zarından Tüm tamponları Filtresi.
  5. Fluorofor görünür ışık, hazırlık ve deneme emer düşük ışık koşulları altında yapılmalıdır.

2. Aracı hazırlık Msh2-Msh6 DNA-bağlayıcı kinetiği

Durdu akış enstrüman prensibi oldukça basit. Bu karışım bir cihazın içine hızla iki sürücü şırınga çözümler itmek için bir tahrik motoru kullanır, karışık çözüm için bir gözlem, veri toplama (Şekil 3) hücre içine akar. Biz KinTek düşük örnek hacmi gerektirir durdu akışı, çeşitli optik sinyalleri, tek veya reaktanlarının karıştırma sıralı olarak algılanmasını sağlar ve kullanımı çok kolay kullanabilirsiniz. Durduruldu akış araçların yanı sıra diğer birçok üretici vardır.

  1. Deneyler için durdu akış alet hazırlamak için, bilgisayar ve denetleyici kapalı olduğundan emin olun. Soğutmak için ortam sıcaklığı ayarlanmış dolaşan su banyosu (C 25 derece) açın. Lambayı ateşleyin. Monokromatör istenen dalgaboyu (2 Aminopurine durumunda 315 nm) ayarlayın. Istenilen yarık genişliği (ampirik olarak düşük photobleaching dengesi yüksek fluorofor uyarma) yarık tekerleği çevirin. Denetleyici ve bilgisayarı açın. Deney sırasında istenilen sıcaklıkta (30 ° C S. cerevisiae Msh2-Msh6 durumunda) reaktanları korur su ceketi doldurmak için dolaşan su banyosu açın.
  2. Sonra, durdu akış programı çalıştırmak. Fluorofor (350 nm 2-Aminopurine durumunda filtre cut-off) için uygun bir girişim filtresi ile photomultiplier tüp (PMT) Bu durumda seçim, dedektör açın. PMT gerilimi uygulayın. Herhangi bir arka plan elektriksel gürültü düzeltmek için karanlık akımı ölçün.
  3. Durdu akış sürücü şırınga ve gözlem hücre örnekleri yüklemeden önce yıkanmalıdır. Örnek Yükleme Vana YÜK konumuna ayarlayın. Bir 1ml şırınga deiyonize, filtrelenmiş su ile doldurun, sürücü şırınga altında bulunan yükleme noktası ekleyin ve iki şırınga birkaç kez el arasında su itin. Deneyde kullanılacak her sürücü şırınga için iki kez bu işlemi tekrarlayın. Daha sonra, gözlem hücre yıkamak için su ile sürücü şırınga doldurun. YANGIN konumuna Örnek Vana Anahtarı yükleniyor. Ayarlama Şırınga Sürücü kullanıntahrik motoru ve gözlem hücresinden geçer ve çıkış hattına su itmek için düşük sürücü plaka kontrol komutu. Sonuna kadar sürücü şırınga pistonu itmek için özen gösterin. Sürücü plakasını kaldırın. Vana YÜK pozisyonuna geçin. El reaksiyon tamponu ile şırınga yıkayın ve boş bırakın. Cihaz artık kullanıma hazır.

3. Msh2-Msh6 DNA bağlayıcı deney ve veri analizi

  1. Her tüpten 1 ml şırınga taze bir örnek aktarın. Her bir örnek şırınga yükleme noktası takın ve sürücü şırıngaya çözüm itin. Aralıklı olarak birkaç kez duraklar iki şırınga elle arasındaki çözüm basarak tüm hava kabarcıklarını çıkarmak için özen gösterin. Alt sürücü plakası temas sürücü şırınga kadar. Reaktanları birkaç dakika için ortam sıcaklığına muvazene edelim.
  2. Veri toplama, Set Time / Channels penceresini açın, veri analizi, veri toplama kanalı (PMT), mod (Floresan) seçin ve izleri sayısı (Shots) tahsil edilecek. 1000 veri noktaları tahsil edilecektir sırasında veri toplama süresi girin. Yavaş fazları tespit etmek için birkaç saniye içinde bilinmeyen bir reaksiyon olarak izlenmelidir. Ampirik denge ya da istikrarlı bir devlet ve ≥ 6 yarısı hayatını kümesi veri toplama süresi ulaşmak için gerekli zaman tahmin ediyoruz. Msh2-Msh6 durumda en uygun zaman çerçevesi 2 saniye G: G: T disosiasyon kinetik T uyumsuzluğu bağlayıcı kinetik ve 60 saniye. Şimdi YANGIN konumuna vana ayarı ve Veri Toplama düğmesini tıklatın. Bu eylem, reaksiyon Msh2-Msh6 ve DNA, giriş gözlem hücre, 2-Aminopurine fluorofor uyarma ve zamanla floresan sinyal toplama karıştırma başlatır. Yüksek kalitede veri elde etmek ve dosyayı kaydetmek için en az 5 kinetik izleri toplayın.
  3. Deney tamamlandığında, lambayı açmak. Daha önce de açıklandığı gibi, su ile şırıngalar ve gözlem hücre yıkayın. Sonra, ekipman, dolaşımdaki su banyosu hariç geri kalanını kapatmak. Soğutmak için ek bir 15 dakika boyunca su dolaştırılır.
  4. Matematik işlemleri ve veri uydurma, deney sırasında reaksiyon kinetiği bir anlamda almak için, KinTek yazılımın kendisi ile yapılabilir. Daha fazla analizi de birden fazla kinetik izleri ortalama tasarrufu ve diğer veri analizi / grafik yazılım için ortalama dosya ihracat yapılabilir.

4. Msh2-Msh6 DNA bağlayıcı kinetiği Temsilcisi sonuçlar

G Msh2 Msh6 etkileşimler için kinetik veriler: T uyumsuzluğu DNA, tek bir üstel fonksiyon için uygun ve yakın ON 3 hızlı bağlanma oranı sabiti k verim x 10 7 M-1 saniye-1 (Şekil 4A) ve yavaş hızla T uyumsuzluğu ve 60 saniye 13 yakın bir yarılanma ömrü ile çok kararlı bir kompleks oluşturur: Msh2 Msh6 G bağlar ortaya koymaktadır 0.012 ikinci -1 (Şekil 4B), asitlik sabiti k KAPALI .

B. Ölçüm Msh2-Msh6 ATPaz Kinetik

1. Msh2 Msh6 ATPaz kinetik deney için numune hazırlama

  1. Msh2 Msh6 hazırlayın ve DNA reaktifler etiketsiz DNA kullanılarak, daha önce açıklanan. Buna ek olarak, E. Fosfat Bağlayıcı Protein (PBP) arındırmak coli ve MDCC fluorofor (Şekil 5) 14,15 ile etiket. MDCC-PBP MDCC floresan (Şekil 6) dramatik bir artış sonucu, (1 x 10 8 M -1 ikinci -1 eşittir ON k) ve (K D = 100 nM) yüksek afinite ile hızlı bir şekilde ücretsiz fosfat bağlar. MDCC-PBP, bu nedenle ön kararlı durum ATP hidrolizi ve fosfat sürümü kinetik 14,15 sağlam bir muhabir. Bu testte için arka plan fosfat seviyesini en aza indirmek için gerekli olduğunu unutmayın; bu nedenle, cam kullanımı TÜM reaktif hazırlık aşamasında kesinlikle kaçınılmalıdır.
  2. Msh2-Msh6 T DNA, 01:01 karışım oranı ile tek bir karıştırma deneyde, 2 mcM ve 3 mcM son konsantrasyonları verir: 6 mcM G ile ya da protein 4 mcM ile bir örnek hazırlayın. Öncesi kararlı durum deneyleri ilgi sinyal tek bir ciro veya ilk birkaç katalitik ciroları yüksek enzim konsantrasyonları gerektirdiğini unutmayın. Taze ATP ve 20 mcM MDCC PBP muhabiri çözünmüş 1 mM içeren başka bir örnek hazırlayın. Pürin nükleozid fosforilaz / ml ve 200 mcM 7-herhangi bir kirlenmesine neden olan fosfat paspas hizmet vermektedir örnekleri, methylguanosine 0.10 Birimleri ekleyin. En az 20 dakika (Tablo 2) buz üzerinde örnekler inkübe edin.

2. Msh2 Msh6 ATPaz kinetik Aracı hazırlığı

  1. Daha önce açıklandığı gibi deneyler için durdu akış enstrüman hazırlayın. Buna ek olarak, sürücü şırınga 0.5 Birimler / ml pürin nu fosfat kirletici paspascleoside fosforilaz ve 200 mcM 20 dakika 7-methylguanosine. 425 nm dalgaboyu ayarlayın ve MDCC-PBP floresan tespiti için PMT ile 450 nm cut-off filtresi kullanın.

3. Msh2-Msh6 ATPaz deney ve veri analizi

  1. Daha önce açıklandığı gibi örnekleri ile sürücü şırınga yükleyin. Veri Toplama Msh2-Msh6 ve zamanla MDCC-PBP floresan birleştiğinde artış ATP ve MDCC-PBP ve monitör fosfat sürümü ile Msh2 Msh6 karıştırmak için tıklayın. Yüksek kaliteli bir veri seti elde etmek ve dosyayı kaydetmek için en az 5 kinetik izleri toplayın. Ortalama birden fazla kinetik izleri ve analiz için veri dosyası ihracat.
  2. Fosfat konsantrasyonu ve MDCC PBP floresan arasında doğrusal bir ilişki belirlemek için bir kalibrasyon eğrisi hazırlayın. Bunu yapmak için, farklı durdu-akış aynı deneysel koşullar altında fosfat konsantrasyonları ve her fosfat konsantrasyonu ölçüm maksimum MDCC-PBP floresan MDCC-PBP karıştırın.
  3. Kalibrasyon eğrisi (Şekil 7) için her fosfat konsantrasyonu karşı maksimum MDCC PBP floresan Arsa ve Msh2 Msh6 reaksiyonlar fosfat konsantrasyonu elde etmek için eğimi kullanın. Arsa fosfat Zamana karşı konsantrasyon ve üstel ve doğrusal bir fonksiyonu veri uygun . Bu fonksiyon, doğrusal kararlı durum faz reaksiyon öncesi kararlı durum ATP hidrolizi ve fosfat serbest bir patlama açıklamaktadır.

4. Msh2-Msh6 ATPaz kinetik Temsilcisi sonuçlar

Msh2-Msh6 hidroliz ATP ve hızla ilk katalitik cirosu 1.4 ikinci -1 bültenleri fosfat kinetik verileri göstermektedir. Bu aşama, 0.2 saniye -1 (Şekil 8A) 7 kat daha yavaş kararlı durum k kedi sonraki cirolar sınırlar reaksiyon yavaş bir adım takip ediyor . Ancak, Msh2-Msh6 eşleşmeyen DNA, ATP hidrolizi ve fosfat serbest patlaması bağlı olduğunda, bastırılmış ve Msh2-Msh6 daha uzun bir süre için bir ATP bağlı durumda kalır.

Şekil 1
Şekil 1. S. Arıtma E. gelen cerevisiae Msh2-Msh6 coli. Msh2 ve Msh6 genler pET11a vektör klonlanmış ve E. üzerinden ifade edildi coli BL21 (de3) hücreleri. SP-sepharose, heparin ve Q-sepharose reçineler üzerinden kolon kromatografisi ile saflaştırılmış protein kompleksi oldu. Burada gösterilen SDS-PAGE analizi, bir Q-sepharose kolon protein fraksiyonları içerir.

Şekil 2
T uyumsuzluğu bitişik bir Adenozin (ATPaz deneyleri için) veya 2-Aminopurine Adenozin floresan temel analog (DNA bağlayıcı deneyleri için): Şekil 2 Tamamlayıcı tek sarmallı DNA'ları G içeren bir dubleks formu tavlanır.

Şekil 3
Şekil 3 KinTek reaktanlarının akışı tek bir karıştırma deney sırasında akış durdu.

Şekil 4a
Şekil 4a, bir G Msh2-Msh6 etkileşim Kinetiği: T uyumsuzluğu . G içeren dubleks DNA (0.12 mcM) Karıştırma: Msh2-Msh6 (0.8 mcM) ile 2-Aminopurine bitişik T zamanla floresan artışa yol açar ve bir iki moleküllü ON = 2.4 oran sabiti k 10 7 -1 s verimleri -1 etkileşim için.

Şekil 4b
Şekil 4b, bir G Msh2-Msh6 etkileşim Kinetiği: T uyumsuzluğu . Karışım önceden oluşmuş Msh2 Msh6 G: T (2-Ap) aşırı etiketsiz G: T DNA (8 mcM) ile karmaşık tuzakları herhangi bir ücretsiz Msh2-Msh6 yol açar, zaman içinde floresan azalma ve yavaş disosiasyon hızı sabit verim, ~ 60 saniye uzun bir yarılanma ömrü ile stabil kompleks belirten KAPALI k = 0.012 s -1. Final konsantrasyonları: 0.4 mcM Msh2-Msh6 işaretli DNA 0.06 mcM, 4 mcM etiketsiz G: T DNA tuzak.

Şekil 5
Şekil 5 MDCC PBP hazırlık. E. SDS-PAGE analizi coli fosfat bağlayıcı protein (PBP), saflaştırılmış ve MDCC fluorofor ile etiketlenir.

Şekil 6
Şekil 6 fosfat MDCC-PBP yanıt. MDCC-fosfat (Pi) sonuçları ile artan MDCC floresan PBP Titrasyon.

Şekil 7a
Şekil 7a hazırlanması fosfat (Pi) standart eğri. Bir MDCC-PBP (20 mcM), Pi değişen miktarlarda (8 mcM 0) ile karıştırılır.denge ulaşılana kadar d floresan zamanla ölçülür. Final konsantrasyonları: 10 mcM MDCC-PBP, 0 - 4 mcM Pi.

Şekil 7b
Şekil 7b hazırlanması fosfat (Pi) standart eğri. Maksimum MDCC-PBP floresan çizilen karşı [Pi] bir standart eğri verim. Hattı (bu durumda 0.383 mcM -1) eğim Pi konsantrasyonu MDCC PBP floresan dönüştürmek için kullanılır.

Şekil 8a
Şekil 8a. Msh2 Msh6 ATPaz kinetiği. Msh2 yokluğunda G-Msh6 (4 mcM): ATP (1 mM) ve MDCC-PBP (20 mcM) ile hızla karıştırılır T DNA, ATP hidrolizi ve Pi serbest bir patlama sergiler. Veri analizi oranı (k hidroliz = 1.4 s -1) ve genlik (2 mcM Msh2-Msh6 başına 1 siteye) veren patlama faz, 0.4 mcM s hızında doğrusal, kararlı durum faz takip 1 (k kedi = 0.2 s -1).

Şekil 8b
Şekil 8b. Msh2 Msh6 ATPaz kinetiği. G Ek: T reaksiyonu DNA (6 mcM) karmaşık bir ATP bağlı devlet stabilize, ATP hidroliz patlama bastırır. Final konsantrasyonları: 2 mcM Msh2 Msh6, 500 mcM ATP 3 mcM DNA, 10 mcM MDCC-PBP. Burst kinetiği aşağıdaki denklemle uygun: [Pi] = 0 E-k t + Vt, [Pi] fosfat konsantrasyonu, A 0, k gözlenen çekim hızı sabit patlama genliği ve V hızı doğrusal faz (k cat = V / [Msh2-Msh6]).

Örnek Protein DNA
Reaktif Hisse senedi Çalışma McL Vol. Hisse senedi Çalışma McL Vol.
Msh2-Msh6 5 mcM 0.8 mcM 64 - - -
2ApG: T - - - 10 mcM 0.12 mcM 4,8
tampon 10x 1x 40 10x 1x 40
GKD 2 O - - 296 - - 355
Toplam 400 400

Tablo 1: DNA bağlama reaksiyon

Örnek Protein Protein-DNA ATP
Reaktif Hisse senedi Çalışma McL Vol. Hisse senedi Çalışma McL Vol. Hisse senedi Çalışma McL Vol.
Msh2-Msh6 20 mcM 4 mcM 80 20 mcM 4 mcM 80 - - -
G: T - - - 100 6 24 - - -
ATP - - - - - - 50 mM 1 mM 8
7-MEG 250x 1x 1,6 250x 1x 1,6 250x 1x 1,6
PNPase 100x 1x 4 100x 1x 4 100x 1x 4
PBP-MDCC 150 mcM 20 mcM 53,3 150 mcM 20 mcM 53,3 - - -
Tampon 10x 1x 40 10x 1x 40 10x 1x 40
GKD 2 O - - 221 - - 197 - - 346
Toplam 400 400 400

Tablo 2 ATPaz tepki

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada açıklanan DNA uyumsuzluğu bağlayıcı protein örneği, biyolojik moleküllerin mekanizmaları çalışmak için geçici kinetik yöntemler ve yardımcı güç göstermektedir. Tek ciro zaman ölçekte Durduruldu akış ölçümleri, uyumsuz bir baz çifti ve reaksiyon 9 uzun ömürlü bir protein X DNA kompleksi oluşumu Msh2-Msh6 protein hızlı ve belirli bağlayıcı için net bir kanıt sağladı. Ayrıca, ATPaz aktivitesi durdu akışı (ve quench akış) analizi, eşleşmeyen DNA bağlayıcı 11,16 sonra ATP bağlı konformasyon Msh2-Msh6 geçiş için doğrudan bir kanıt sağladı. Bu anahtar, DNA onarımı 17,18 sinyal hipotezi. Bu tür tamamlayıcı yüksek çözünürlüklü yapısal veri ile birlikte yüksek çözünürlüklü kinetik verileri, makromoleküler fonksiyonu anlayışı ilerletmek için çok önemlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Bu çalışma, bir NSF KARİYER Ödülü (MMH), Barry M. Goldwater bursu (FNB) ve ASBMB Lisans Araştırma Ödülü (CWD) tarafından desteklenmiştir. PBP, ifade için klon lütfen Dr. Martin Webb (MRC, UK) tarafından sağlanmıştır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37 G DNA Sequence: 5’- ATT TCC TTC AGC AGA TAT G T A CCA TAC TGA TTC ACA T -3’
37 T (2-Ap) DNA Sequence: 5’- ATG TGA ATC AGT ATG GTA TApT ATC TGC TGA AGG AAA T -3’
37 T DNA Sequence: 5’- ATG TGA ATC AGT ATG GTA T A T ATC TGC TGA AGG AAA T -3’

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johnson, K. A. Advances in transient-state kinetics. Curr Opin Biotechnol. 9, (1), 87-89 (1998).
  2. Johnson, K. A. E. Kinetic analysis of macromolecules. Oxford University Press. (2003).
  3. Obmolova, G., Ban, C., Hsieh, P., Yang, W. Crystal structures of mismatch repair protein MutS and its complex with a substrate DNA. Nature. 407, (6805), 703-710 (2000).
  4. Lamers, M. H. The crystal structure of DNA mismatch repair protein MutS binding to a G x T mismatch. Nature. 407, (6805), 711-717 (2000).
  5. Warren, J. J. Structure of the human MutSalpha DNA lesion recognition complex. Mol Cell. 26, (4), 579-592 (2007).
  6. Kunkel, T. A. &, Erie, D. A. DNA Mismatch Repair. Annu Rev Biochem. 74, 681-710 (2005).
  7. Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, (5), 335-346 (2006).
  8. Hsieh, P., Yamane, K. DNA mismatch repair: Molecular mechanism, cancer, and ageing. Mech Ageing Dev. 129, (7-8), 391-407 (2008).
  9. Jacobs-Palmer, E., Hingorani, M. M. The effects of nucleotides on MutS-DNA binding kinetics clarify the role of MutS ATPase activity in mismatch repair. J Mol Biol. 366, (4), 1087-1098 (2007).
  10. Antony, E., Khubchandani, S., Chen, S., Hingorani, M. M., M, M. Contribution of Msh2 and Msh6 subunits to the asymmetric ATPase and DNA mismatch binding activities of Saccharomyces cerevisiae Msh2-Msh6 mismatch repair protein. DNA Repair (Amst). 5, (2), 153-162 (2006).
  11. Antony, E., Hingorani, M. M. Mismatch recognition-coupled stabilization of Msh2-Msh6 in an ATP-bound state at the initiation of DNA repair. Biochemistry. 42, (25), 7682-7693 (2003).
  12. Finkelstein, J., Antony, E., Hingorani, M. M., O'Donnell, M. Overproduction and analysis of eukaryotic multiprotein complexes in Escherichia coli using a dual-vector strategy. Anal Biochem. 319, (1), 78-87 (2003).
  13. Zhai, J., Hingorani, M. M. S. cerevisiae Msh2-Msh6 DNA binding kinetics reveal a mechanism of targeting sites for DNA mismatch repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (2), 680-685 (2010).
  14. Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Webb, M. R. Direct, real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33, (27), 8262-8271 (1994).
  15. Brune, M. Mechanism of inorganic phosphate interaction with phosphate binding protein from Escherichia coli. Biochemistry. 37, (29), 10370-10380 (1998).
  16. Antony, E., Hingorani, M. M. Asymmetric ATP binding and hydrolysis activity of the Thermus aquaticus MutS dimer is key to modulation of its interactions with mismatched DNA. Biochemistry. 43, (41), 13115-13128 (2004).
  17. Gradia, S., Acharya, S., Fishel, R. The human mismatch recognition complex hMSH2-hMSH6 functions as a novel molecular switch. Cell. 91, (7), 995-1005 (1997).
  18. Mazur, D. J., Mendillo, M. L., Kolodner, R. D., D, R. Inhibition of Msh6 ATPase activity by mispaired DNA induces a Msh2(ATP)-Msh6(ATP) state capable of hydrolysis-independent movement along DNA. Mol Cell. 22, (1), 39-49 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats