Tillämpning av Stoppad-flöde Kinetics metoder för att undersöka verkningsmekanismen av en DNA Repair Protein

Published 3/31/2010
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

MSH2-Msh6 är ansvarig för att initiera reparation av replikering fel i DNA. Här presenterar vi ett övergående kinetik strategi för att förstå hur denna kritiska proteinet fungerar. Rapporten belyser slutade flöde experiment för att mäta det kopplade DNA-bindande och ATPas kinetik underliggande MSH2-Msh6 verkningsmekanism i DNA-reparation.

Cite this Article

Copy Citation

Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein. J. Vis. Exp. (37), e1874, doi:10.3791/1874 (2010).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Övergående kinetisk analys är nödvändig för att förstå fungerar biologiska makromolekyler, eftersom denna metod ger mekanistiska information inklusive aktiva site koncentrationer och inneboende konstanter takt som styr makromolekylära funktion. I händelse av enzymer, till exempel, övergående eller pre-steady state mätningar identifiera och karaktärisera enskilda händelser i reaktionen väg, medan steady-state mätningar endast ger övergripande katalytisk effektivitet och specificitet. Enskilda händelser som protein-protein eller protein-ligand interaktioner och hastighetsbestämmande konformationsändringar förekommer ofta i millisekund tid, och kan mätas direkt med stoppade flöde och kemisk-släcka flöde metoder. Med tanke på en optisk signal som fluorescens, stannade-flöde fungerar som ett kraftfullt och lättillgängligt verktyg för att övervaka reaktion framsteg från substrat binda till produktlansering och katalytisk omsättningen 1,2.

Här rapporterar vi tillämpa slutade flöde kinetik att söka av verkningsmekanismen för MSH2-Msh6, en eukaryot DNA-reparation protein som erkänner baspar obalanser och insättning / borttagning loopar i DNA och signaler mismatch reparation (MMR) 3-5. På så sätt hjälper MSH2-Msh6 ökar noggrannheten i DNA-replikation av tre tiopotenser (felfrekvens minskar från ~ 10 -6 till 10 -9 baser), och därmed bevara genomisk integritet. Inte överraskande är defekt mänsklig MSH2-Msh6 funktion i samband med ärftlig icke-polypos tjocktarmscancer och andra sporadiska cancerformer 6-8. För att förstå verkningsmekanismen av denna kritiska DNA metabola protein, vi sondera dynamiken i MSH2-Msh6 interaktion med inkompatibla DNA samt ATPas aktivitet som drivmedel sitt handlande i MMR. DNA-bindande mäts genom att snabbt blanda MSH2-Msh6 med DNA som innehåller en 2-aminopurine (2-Ap) fluoroforen anslutning till ett G: T obalans och övervaka den resulterande ökningen i 2-aminopurine fluorescens i realtid. DNA dissociation mäts genom att blanda förformade MSH2-Msh6 G: T (2-Ap) mismatch komplex med omärkta fälla DNA och övervakning minskning fluorescens över tiden 9. Pre-steady state ATPas kinetik mäts genom förändringen i fluorescens av 7-dietylamino-3-((((2-maleimidyl) etyl) amino) karbonyl) kumarin)-märkta fosfat bindande protein (MDCC-PBP) om bindande fosfat ( Pi) släpptes av MSH2-Msh6 efter ATP hydrolys 9,10.

Uppgifterna visar en snabb bindning av MSH2-Msh6 till ett G: T obalans och bildandet av ett långlivat MSH2-Msh6 G: T komplex, vilket i sin tur resulterar i hämning av ATP hydrolys och stabilisering av protein i en ATP-bunden form . Den reaktionskinetik ger tydligt stöd för hypotesen att ATP-bundet MSH2-Msh6 signaler DNA-reparation om bindande ett omaka baspar i dubbelspiral.

F. Noah Biro och Jie Zhai bidragit till detta papper lika.

Protocol

A. Mätning av MSH2-Msh6 DNA-bindande Kinetics

1. Provberedning för MSH2-Msh6 DNA-bindande kinetik experiment

Beredning av reagenser för en fluorescens-baserad kinetiska DNA-bindande experiment på ett stoppat-flöde liknar den för en jämvikt experiment på ett fluorometer. Faktum jämvikt bindande analys bör utföras först uppskatta dissociationskonstanten (K D) för samverkan i syfte att optimera reaktionen förutsättningar för kinetisk analys. Stoppad-flöde experiment kräver större mängder av biologiskt material jämfört med jämvikt eller steady-state experiment, och därför är den metod mest genomförbara när låg milligram mängder protein finns 11,12 och liknande mängder av ligander kan förberedas eller köpas.

  1. Vi över-express S. cerevisiae MSH2-Msh6 i E. coli och rena milligram mängder av proteinet genom jonbyteskromotografi (Fig. 1) 11.
  2. DNA-reagenser med eller utan 2-Aminopurine fluoroforen kan kemiskt syntetiserade. Vi köper 37 nukleotid längd enkelsträngat DNA modifierad med 2-Aminopurine och glödga två kompletterande delar för att förbereda duplex DNA med 2-Aminopurine anslutning till ett G: T mismatch (Fig. 2). DNA kan renas av tillverkaren eller i laboratorium med denaturering elektrofores polyakrylamidgel, den senare i allmänhet ger högre avkastning.
  3. För DNA-bindande kinetik förbereds separata G: T (2-Ap) DNA och MSH2-Msh6 prov protein i DNA-bindande buffert (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5 mm MgCl 2, 100 mM NaCl). MSH2-Msh6 och koncentrationer DNA 0,8 mikroM och 0,12 mikroM respektive, vilket ger 0,4 ìm och 0,06 mikroM slutliga koncentrationer i en enda blandning experimentera med 1:01 blandningsförhållande. För DNA-dissociation kinetik, förbereda ett prov som innehåller 0,8 mikroM MSH2-Msh6 och 0,12 mikroM G: T (2-Ap) DNA, och ett annat prov med 8 mikroM omärkta G: T-DNA som en fälla för fri MSH2-Msh6. Förbered och lagra proverna på is. I dessa reaktioner är proteinkoncentration väl över 10 nm K D för MSH2-Msh6-DNA-interaktion och DNA-koncentrationen är tillräckligt för en robust fluorescenssignalen (bestäms empiriskt). En volym av 400 l per prov räcker för att få ca 10 kinetisk spår (tabell 1).
  4. Använd hög kvalitet kemikalier som är fria från fluorescerande föroreningar i protein, DNA, och förberedelser buffert. Filtrera alla buffertar genom ett 0,2 ìm membran för att undvika igensättning stoppad-flöde med partiklar.
  5. Om fluoroforen absorberar synligt ljus, förberedelse och experiment måste utföras under dåliga ljusförhållanden.

2. Instrument förberedelse för MSH2-Msh6 DNA-bindande kinetik

En stoppad-flow instrumentet är mycket enkelt i princip. Den använder en motor för att snabbt trycka två lösningar köra sprutor i en blandning enhet, flyter den blandade lösningen sedan till en observation cell för insamling av data (Fig. 3). Vi använder KinTek slutade-flöde, som kräver låg provvolym, tillåter enkel eller sekventiell blandning av reaktanter, upptäckt av en mängd olika optiska signaler, och är mycket lätt att använda. Stoppad flöde instrument finns tillgängliga från flera andra tillverkare också.

  1. För att förbereda de slutade flöde instrument för experiment, se till att datorn och styrenheten är avstängda. Slå på cirkulerande vattenbad ställa till rumstemperatur (25 grader, C) för att kyla lampan. Tänd lampan. Ställ monokromator till önskad excitationsvåglängden (315 nm vid 2-Aminopurine). Vrid springa hjulet till önskad springa bredd (empiriskt balans hög fluoroforen excitation med låg fotoblekning). Slå på styrenheten och datorn. Slå på cirkulerande vattenbad för att fylla vatten jacka som upprätthåller reaktanterna vid en önskad temperatur under försöket (30 ° C i händelse av S. cerevisiae MSH2-Msh6).
  2. Därefter kör slutade flöde programmet. Slå på detektorn val, vilket i detta fall är en fotomultiplikatorn rör (PMT) med en inblandning filter lämpliga för fluoroforen (350 nm cut-off-filter vid 2-Aminopurine). Applicera spänning till PMT. Mät mörka gällande att korrigera för eventuella bakgrunden elektriska störningar.
  3. Det slutade flöde köra sprutor och observation cell måste tvättas före lastning proverna. Ställ Valve Sample Fylla till lastens läge. Fyll en 1 ml spruta med avjoniserat, filtrerat vatten, bifoga den till lastningshamnen ligger under enheten sprutan, och manuellt tryck vattnet mellan de två sprutorna några gånger. Upprepa processen två gånger för varje enhet sprutan som används i experimentet. Därefter fyller den enhet sprutor med vatten för att tvätta observation cellen. Stäng av Valve Sample Fylla till branden position. Använd Justera spruta Drivekommandot, som kontrollerar motor, och sänk Drivplatta att driva vatten genom observation cellen och in i avsluta linjen. Var noga med att inte trycka kolven ända till slutet av enheten sprutan. Höj enheten plattan. Stäng av ventilen till lastens läge. Manuellt tvätta sprutor med reaktionen buffert och lämna tomt. Instrumentet är nu redo för användning.

3. MSH2-Msh6 DNA-bindande experiment och dataanalys

  1. Överför varje prov från röret till en ny 1 ml spruta. Fäst varje prov sprutan en lastningshamnen och tryck lösningen i enheten sprutan. Var noga med att ta bort alla luftbubblor genom att manuellt trycka in lösningen mellan de två sprutor ett par gånger med återkommande pauser. Nedre enheten plattan tills den kommer i kontakt toppen av enheten sprutor. Låt reaktanter jämvikt till rumstemperatur i några minuter.
  2. För datainsamling, öppna Set Time / Kanaler fönstret väljer datainsamling kanal (PMT), läge för dataanalys (fluorescens), och antalet spår (bilder) som ska samlas in. Skriv in datainsamlingen tid under vilken 1000 datapunkter kommer att samlas in. En okänd reaktion bör övervakas under flera sekunder för att upptäcka eventuella långsamma faser. Empiriskt uppskatta den tid som krävs för att nå jämvikt eller steady state och data som hämtas är till ≥ 6 halv liv. Vid MSH2-Msh6 den optimala tidsramen är 2 sekunder för G: T mismatch bindande kinetik och 60 sekunder för G: T dissociation kinetik. Nu ställa in ventilen till BRAND position och klicka på Samla in data-knappen. Denna åtgärd initierar blandning av MSH2-Msh6 och DNA, inträde av reaktionen i observationen cellen, excitation av 2-Aminopurine fluoroforen och insamling av den fluorescens signalen över tiden. Samla minst 5 kinetisk spår för att få högkvalitativa data och spara filen.
  3. När experimentet är klar, stäng av lampan. Tvätta sprutor och observation cell med vatten enligt tidigare. Stäng sedan resten av utrustningen, utom för cirkulerande vatten bad. Vattnet cirkulerar i ytterligare 15 minuter för att kyla lampan.
  4. Matematiska operationer och data montering kan utföras med KinTek själva programvaran, för att få en känsla av reaktionskinetik under experimentet. Ytterligare analyser kan även utföras som genomsnittet av flera kinetiska spår och att spara och exportera genomsnitt filen till andra data analys / grafiska program.

4. Representativa resultat för MSH2-Msh6 DNA-bindande kinetik

Kinetiska data för MSH2-Msh6 interaktioner med G: T obalans DNA, kan passa till en enda exponentiell funktion och ger en snabb bindande hastighetskonstant K nära 3 x 10 7 M-1 sekund-1 (Fig. 4A) och en långsam dissociationskonstant k OFF 0,012 second -1 (Fig. 4B), som visar att MSH2-Msh6 binder ett G: T mismatch snabbt och bildar ett mycket stabilt komplex med en halveringstid nära 60 sekunder 13.

B. Mätning av MSH2-Msh6 ATPas Kinetics

1. Provberedning för MSH2-Msh6 ATPas kinetik experiment

  1. Förbered MSH2-Msh6 och DNA reagenser som tidigare beskrivits, med hjälp av omärkta DNA. Dessutom renar Fosfat bindande protein (PBP) från E. coli och märk den med MDCC fluoroforen (bild 5) 14,15. MDCC-PBP binder fritt fosfat snabbt (K motsvarar 1 x 10 8 M -1 second -1) och med hög affinitet (K D = 100 nM), vilket resulterar i en dramatisk ökning av MDCC fluorescens (bild 6). MDCC-PBP är därför en robust reporter av pre-steady state ATP hydrolys och fosfat släpper kinetik 14,15. Observera att det är viktigt att minimera bakgrundsnivåer fosfat för denna analys, och därför bör användning av glas strikt undvikas i alla skeden av REAGENSBEREDNING.
  2. Bered ett prov med 4 mikroM MSH2-Msh6 protein med eller utan sex mikroM G: T-DNA, vilket ger 2 mikroM och 3 mikroM slutliga koncentrationer i en enda blandning experimentera med 1:01 blandningsförhållande. Observera att pre-steady state experiment kräver hög enzym koncentrationer eftersom signalen av intresse från en enda omsättning eller de första katalytiska omsättning. Förbered ett annat prov som innehåller 1 mM färska upplöst ATP och 20 mikroM MDCC-PBP reporter. Lägg till 0,10 enheter / ml av purin nukleosidanalog phosphorylase och 200 mikroM 7-methylguanosine vid proverna, som tjänar till att torka upp eventuella kontaminerande fosfat. Inkubera prov på is i minst 20 minuter (tabell 2).

2. Instrument förberedelse för MSH2-Msh6 ATPas kinetik

  1. Förbered slutade flöde instrument för experiment som beskrivits tidigare. Dessutom torka upp fosfat föroreningar från enheten sprutor med 0,5 enheter / ml purin nucleoside phosphorylase och 200 mikroM 7-methylguanosine i 20 minuter. Ställ excitationsvåglängden till 425 nm och använda en 450 nm cut-off-filter med PMT för detektion av MDCC-PBP fluorescens.

3. MSH2-Msh6 ATPas experiment och dataanalys

  1. Ladda enheten sprutor med de prover som beskrivits ovan. Klicka på Samla in data för att blanda MSH2-Msh6 med ATP och MDCC-PBP och övervaka fosfat släpp av MSH2-Msh6 och den kopplade ökningen MDCC-PBP fluorescens över tiden. Samla minst 5 kinetisk spår för att få en hög kvalitet datauppsättning och spara filen. Genomsnittlig flera kinetiska spår och exportera data fil för analys.
  2. Förbered en kalibreringskurva för att bestämma den linjära sambandet mellan fosfat och MDCC-PBP fluorescens. För att göra det, blanda MDCC-PBP med olika fosfat koncentrationer under samma experimentella förhållanden i slutat-flöde, och mäta maximal MDCC-PBP fluorescens vid varje fosfat.
  3. Plotta den maximala MDCC-PBP fluorescens kontra varje fosfatkoncentrationen för kalibreringskurvan (bild 7) och använd lutningen för att få fosfatkoncentrationen i MSH2-Msh6 reaktioner. Tomt fosfatkoncentrationen tiden och passar data till en exponentiell och linjär funktion. Denna funktion beskriver en explosion av pre-steady state ATP hydrolys och fosfat släpper följt av linjära steady state fasen av reaktionen.

4. Representativa resultat för MSH2-Msh6 ATPas kinetik

Den kinetiska data visar att MSH2-Msh6 hydrolyserar ATP och frigör fosfat snabbt i 1,4 second -1 i första katalytiska omsättningen. Denna fas följs av en långsam steg i reaktionen som begränsar efterföljande omsättning till en 7-faldig långsammare steady state k katt på 0,2 sekunder -1 (Fig. 8A). Men är då MSH2-Msh6 är bunden till omaka DNA, brast av ATP hydrolys och fosfat frigöra undertryckta och MSH2-Msh6 kvar i en ATP-bundet under en längre tid.

Figur 1
Figur 1. Rening av S. cerevisiae MSH2-Msh6 från E. coli. MSH2 och Msh6 gener har klonat in pET11a vektor och överrepresenterade i E. coli BL21 (DE3) celler. Den proteinkomplex renades genom kolonnkromatografi över SP-sepharose, heparin, och Q-sepharose hartser. SDS-PAGE analys visas här innehåller protein fraktioner från ett Q-sepharose kolumn.

Figur 2
. Figur 2 Kompletterande enkelsträngat DNA glödgas för att bilda en dubbelsidig innehåller G: T obalans med ett intilliggande Adenosin (för ATPas experiment) eller 2-Aminopurine fluorescerande bas analog av adenosin (för DNA-bindande experiment).

Figur 3
Figur 3. Flöde av reaktanter i KinTek slutade-flow under en enda blandning experiment.

Figur 4a
Figur 4a kinetik MSH2-Msh6 interaktion med ett G:. T obalans. Blandning av duplex-DNA (0,12 M) som innehåller en G: T i anslutning till 2-Aminopurine med MSH2-Msh6 (0,8 M) leder till ökning av fluorescens över tiden och ger en bimolecular hastighetskonstant K på = 2,4 10 7 m -1 s -1 för interaktionen.

Figur 4b
Figur 4b kinetik MSH2-Msh6 interaktion med ett G:. T obalans. Blandning förformade MSH2-Msh6 G: T (2-Ap) komplex med överskott omärkta G: T-DNA (8 M) som fångar några gratis MSH2-Msh6 leder till en minskning av fluorescens över tiden och ger en långsam dissociation hastighetskonstant, k OFF = 0,012 s -1, vilket indikerar ett stabilt komplex med en lång halveringstid på ~ 60 sekunder. Slutliga koncentrationer: 0,4 mikroM MSH2-Msh6, 0,06 mikroM märkt DNA, 4 mikroM utan etikett G: T-DNA fälla.

Figur 5
Figur 5. MDCC-PBP beredning. SDS-PAGE analys av E. coli fosfat bindande protein (PBP), renat och märkta med MDCC fluoroforen.

Figur 6
Figur 6. MDCC-PBP svar på fosfat. Titrering av MDCC-PBP med fosfat (Pi) resulterar i ökad MDCC fluorescens.

Figur 7a
Figur 7a. Förberedelse av fosfat (Pi) standardkurvan. MDCC-PBP (20 M) blandas med olika mängder Pi (0-8 M) end fluorescensen mäts över tid tills jämvikt har uppnåtts. Slutliga koncentrationer: 10 mikroM MDCC-PBP, 0 till 4 mikroM Pi.

Figur 7b
Figur 7b. Förberedelse av fosfat (Pi) standardkurvan. Maximal MDCC-PBP fluorescens är ritas [Pi] för att ge en standardkurva. Lutningen på linjen (0,383 mikroM -1 i detta fall) används för att omvandla MDCC-PBP fluorescens i Pi koncentration.

Figur 8a
Figur 8a. MSH2-Msh6 ATPas kinetik. MSH2-Msh6 (4 M), i avsaknad G: T-DNA, blandas snabbt med ATP (1 mm) och MDCC-PBP (20 M) uppvisar en explosion av ATP hydrolys och Pi release. Dataanalys ger den hastighet (k hydrolys = 1,4 s -1) och amplitud (2 mikroM, 1 plats per MSH2-Msh6) av brast fasen, som följs av en linjär, steady state fas med en hastighet av 0,4 mikroM s - 1 (k cat = 0,2 s -1).

Figur 8b
Figur 8b. MSH2-Msh6 ATPas kinetik. Tillägg av G: T-DNA till en reaktion (6 M) undertrycker brast av ATP hydrolys, stabilisera den komplexa i en ATP-bundet tillstånd. Slutliga koncentrationer: 2 mikroM MSH2-Msh6, 500 mikroM ATP, 3 mikroM DNA, 10 mikroM MDCC-PBP. Burst kinetik är lämpliga med följande ekvation: [Pi] = A 0 E-k t + Vt, där [Pi] är fosfatkoncentrationen A 0 är den brast amplituden, k är den observerade sprack hastighetskonstant och V är hastigheten den linjära fasen (k cat = V / [MSH2-Msh6]).

Exempel på Protein DNA
Reagens Stock Arbeta Vol, mikroliter Stock Arbeta Vol, mikroliter
MSH2-Msh6 5 mikroM 0,8 mikroM 64 - - -
2ApG: T - - - 10 mikroM 0,12 mikroM 4,8
buffert 10x 1x 40 10x 1x 40
DDH 2 O - - 296 - - 355
Totalt 400 400

Tabell 1 DNA-bindande reaktion

Exempel på Protein Protein-DNA ATP
Reagens Stock Arbeta Vol, mikroliter Stock Arbeta Vol, mikroliter Stock Arbeta Vol, mikroliter
MSH2-Msh6 20 mikroM 4 mikroM 80 20 mikroM 4 mikroM 80 - - -
G: T - - - 100 6 24 - - -
ATP - - - - - - 50 mM 1 mM 8
7-MEG 250X 1x 1,6 250X 1x 1,6 250X 1x 1,6
PNPase 100x 1x 4 100x 1x 4 100x 1x 4
PBP-MDCC 150 mikroM 20 mikroM 53,3 150 mikroM 20 mikroM 53,3 - - -
Buffer 10x 1x 40 10x 1x 40 10x 1x 40
DDH 2 O - - 221 - - 197 - - 346
Totalt 400 400 400

Tabell 2 ATPas reaktion

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Exemplet med en DNA mismatch protein som beskrivs här illustrerar kraften och nyttan av övergående kinetiska metoder för att studera de mekanismer av biologiska molekyler. Stoppad-flödesmätning om den gemensamma omsättningen tidsskalan som entydiga bevis för snabb och specifik bindning av MSH2-Msh6 protein till ett omaka baspar och bildandet av ett långlivat protein X DNA-komplex i reaktionen 9. Dessutom tillhandahålls slutade-flöde (och släcka-flöde) analys av ATPas aktivitet direkta bevis för MSH2-Msh6 byta till en ATP-bundna konformation efter bindande stämmer DNA 11,16. Denna switch är en hypotes att signalera DNA-reparation 17,18. Sådana högupplösta kinetiska data, tillsammans med kompletterande högupplösande strukturella uppgifter är nödvändiga för att främja förståelsen av makromolekylära funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av en NSF KARRIÄR Award (MMH), en Barry M. Goldwater stipendium (FNB) och en ASBMB Grundutbildning Research Award (CWD). Den klon för över-uttryck av PBP var vänligt tillhandahålls av Dr Martin Webb (MRC, Storbritannien).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37 G DNA Sequence: 5’- ATT TCC TTC AGC AGA TAT G T A CCA TAC TGA TTC ACA T -3’
37 T (2-Ap) DNA Sequence: 5’- ATG TGA ATC AGT ATG GTA TApT ATC TGC TGA AGG AAA T -3’
37 T DNA Sequence: 5’- ATG TGA ATC AGT ATG GTA T A T ATC TGC TGA AGG AAA T -3’

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johnson, K. A. Advances in transient-state kinetics. Curr Opin Biotechnol. 9, (1), 87-89 (1998).
  2. Johnson, K. A. E. Kinetic analysis of macromolecules. Oxford University Press. (2003).
  3. Obmolova, G., Ban, C., Hsieh, P., Yang, W. Crystal structures of mismatch repair protein MutS and its complex with a substrate DNA. Nature. 407, (6805), 703-710 (2000).
  4. Lamers, M. H. The crystal structure of DNA mismatch repair protein MutS binding to a G x T mismatch. Nature. 407, (6805), 711-717 (2000).
  5. Warren, J. J. Structure of the human MutSalpha DNA lesion recognition complex. Mol Cell. 26, (4), 579-592 (2007).
  6. Kunkel, T. A. &, Erie, D. A. DNA Mismatch Repair. Annu Rev Biochem. 74, 681-710 (2005).
  7. Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, (5), 335-346 (2006).
  8. Hsieh, P., Yamane, K. DNA mismatch repair: Molecular mechanism, cancer, and ageing. Mech Ageing Dev. 129, (7-8), 391-407 (2008).
  9. Jacobs-Palmer, E., Hingorani, M. M. The effects of nucleotides on MutS-DNA binding kinetics clarify the role of MutS ATPase activity in mismatch repair. J Mol Biol. 366, (4), 1087-1098 (2007).
  10. Antony, E., Khubchandani, S., Chen, S., Hingorani, M. M., M, M. Contribution of Msh2 and Msh6 subunits to the asymmetric ATPase and DNA mismatch binding activities of Saccharomyces cerevisiae Msh2-Msh6 mismatch repair protein. DNA Repair (Amst). 5, (2), 153-162 (2006).
  11. Antony, E., Hingorani, M. M. Mismatch recognition-coupled stabilization of Msh2-Msh6 in an ATP-bound state at the initiation of DNA repair. Biochemistry. 42, (25), 7682-7693 (2003).
  12. Finkelstein, J., Antony, E., Hingorani, M. M., O'Donnell, M. Overproduction and analysis of eukaryotic multiprotein complexes in Escherichia coli using a dual-vector strategy. Anal Biochem. 319, (1), 78-87 (2003).
  13. Zhai, J., Hingorani, M. M. S. cerevisiae Msh2-Msh6 DNA binding kinetics reveal a mechanism of targeting sites for DNA mismatch repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (2), 680-685 (2010).
  14. Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Webb, M. R. Direct, real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33, (27), 8262-8271 (1994).
  15. Brune, M. Mechanism of inorganic phosphate interaction with phosphate binding protein from Escherichia coli. Biochemistry. 37, (29), 10370-10380 (1998).
  16. Antony, E., Hingorani, M. M. Asymmetric ATP binding and hydrolysis activity of the Thermus aquaticus MutS dimer is key to modulation of its interactions with mismatched DNA. Biochemistry. 43, (41), 13115-13128 (2004).
  17. Gradia, S., Acharya, S., Fishel, R. The human mismatch recognition complex hMSH2-hMSH6 functions as a novel molecular switch. Cell. 91, (7), 995-1005 (1997).
  18. Mazur, D. J., Mendillo, M. L., Kolodner, R. D., D, R. Inhibition of Msh6 ATPase activity by mispaired DNA induces a Msh2(ATP)-Msh6(ATP) state capable of hydrolysis-independent movement along DNA. Mol Cell. 22, (1), 39-49 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats