MALDI preparação da amostra: o método de Camada Ultra Thin

Biology

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Summary

Este vídeo demonstra a preparação de uma ultra-fina camada de matriz / analito para a análise de peptídeos e proteínas por Matrix Assisted Laser-ionização dessorção Espectrometria de Massa (MALDI-MS).

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Fenyo, D., Wang, Q., DeGrasse, J. A., Padovan, J. C., Cadene, M., Chait, B. T. MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method. J. Vis. Exp. (3), e192, doi:10.3791/192 (2007).

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Abstract

Este vídeo demonstra a preparação de uma ultra-fina camada de matriz / analito para a análise de peptídeos e proteínas por Matrix Assisted Laser-ionização dessorção Espectrometria de Massa (MALDI-MS) 1, 2. O método de camada ultra-fina envolve a produção de uma camada de substrato de cristais de matriz (alfa-ciano-4-hidroxicinâmicos ácido) na placa de amostra, que serve como um campo de semeadura para a cristalização de uma mistura subseqüentes matriz / analito. Vantagens do método de camada ultra-fina sobre abordagens outra amostra de deposição (gotículas secas, por exemplo) são de que ele fornece (i) maior tolerância às impurezas tais como sais e detergentes, (ii) uma melhor resolução, e (iii) maior uniformidade espacial. Este método é especialmente útil para a determinação da massa exata de proteínas. O protocolo foi inicialmente desenvolvido e otimizado para a análise das proteínas da membrana e utilizado com sucesso para analisar os canais de íons, transportadores metabólito, e receptores, contendo entre 2 e 12 domínios transmembrana 2. Desde a publicação original, também tem mostrado ser igualmente útil para a análise de proteínas solúveis. Na verdade, nós tê-lo usado para um grande número de proteínas tendo uma vasta gama de propriedades, incluindo aqueles com massas moleculares tão alto quanto 380 kDa 3. Hoje é o nosso método de escolha para a análise de massa molecular de todas as proteínas. O procedimento descrito produz consistentemente de alta qualidade espectros, e é sensível, robusto e fácil de implementar.

Protocol

É muito importante usar luvas sem pó durante a preparação da camada fina.

Limpeza da placa de amostra

  1. Use um aço inoxidável ou ouro placa amostra MALDI.
  2. Lavar com MeOH e limpe delicadamente com um Kimwipe. Não esfregue ou esfregar a superfície com o Kimwipe, para evitar arranhar a superfície.
  3. Lavar com H 2 O e limpe delicadamente com um Kimwipe.
  4. Lavar com MeOH e limpe delicadamente com um Kimwipe.
  5. Se necessário, repita MeOH / H 2 O ciclo de limpeza / MeOH, sempre terminando com MeOH.
  6. Certifique-se que não há manchas fantasma ou resíduo restante no prato. Se houver manchas fantasma, lavar a placa com água deionizada, enquanto esfregando a superfície com a mão enluvada (Não esfregue com Kimwipes). Repita o MeOH / H 2 O ciclo de limpeza / MeOH.
  7. Use a placa imediatamente após a lavagem.

Preparação da solução fina camada de substrato

  1. Misture 1 parte de saturada 4 HCCA (2 partes ACN, 1 parte de água, e 0,1% TFA final) e 3 partes de isopropanol.

    Nota: A solução de substrato em camada fina é muito estável, e pode ser mantido em temperatura ambiente no escuro durante um ano. Também pode ser armazenado a 4 ° C.

Fazendo a fina camada de substrato

  1. Aplicar 20 50μL da solução de camada fina de substrato sobre o centro-esquerda do prato, e espalhar com o lado de uma ponta da pipeta. Varredura em uma direção.
  2. Como a seca solução, a evaporação do solvente orgânico muito rapidamente, deixando para trás gotas minúsculas de água na superfície da placa. Neste ponto, enrole seu dedo indicador com uma camada de Kimwipe e inicialmente suavemente blot a superfície da placa com ele.
  3. Quando a superfície está livre de pingos de água, limpe toda a placa com uni-direcional movimentos arrebatadores usando um Kimwipe.

    Nota: Se a solução não se espalhe o suficiente ao longo da superfície da placa, o aumento da composição ACN e recriar a camada fina. Alguns parâmetros que podem afetar a propagação da solução incluem umidade do ambiente e da temperatura.

    Nota: Com placas de ouro, a camada geralmente aparece como um reflexo amarelado, dependendo da visão e ângulos de luz. Com chapas de aço, apenas a borda da camada é normalmente visível.

  4. Limpe as bordas do prato com um Kimwipe fresco antes de o colocar no suporte da placa para evitar a contaminação da matriz de instrumento.

Preparação da solução da matriz

  1. Saturado de 4 HCCA em FWI (3 partes de ácido fórmico, 1 parte de água, 2 partes de isopropanol) é recomendada para análise de ambas as membranas e proteínas solúveis. Também pode ser usado em casos especiais para a análise de muito hidrofóbicas grandes peptídeos (M> 4.000 u). Certifique-se que a solução matriz utilizada para detectar as proteínas não exceda ~ 50% de conteúdo orgânico, uma vez que irá dissolver completamente o substrato camada fina, derrotando as vantagens do método.

Teste do substrato camada fina

  1. 0.5μL local da solução matriz na placa. Um precipitado esbranquiçado aparecerá na interface entre a camada fina ea gota. Quando esta camada cobre o fundo da gota inteiramente, geralmente dentro de 10-15 segundos, aspirar o excesso de líquido com uma linha de vácuo. Se demorar mais de 30 segundos para o precipitado para formar, é uma indicação de que pode haver um problema com o substrato em camada fina e / ou a solução matriz.

Aplicação de exemplo

  1. A concentração do analito nas soluções de partida deve ser no prazo de 10 e 1000μM.
  2. Diluir a solução do analito em solução de matriz para uma concentração de analito final entre 0,2 e 2μM. Por exemplo, comece com 1μl de amostra e 9μl de solução matriz.

    Nota: Certifique-se que a matriz está perto de ser saturada na solução final, caso contrário você vai dissolver o substrato em camada fina.

    Nota: As concentrações do analito necessária para obter sinais decente são altamente dependentes da complexidade da solução e composição (por exemplo, contaminantes) e ionizability analito.

    Nota: Se uma única etapa de diluição não produz bons resultados, você deve tentar mais um passo de diluição. Embora contra-intuitiva, as soluções de analito altamente concentrada raramente produzem espectros bom.

    Nota: as proteínas da membrana geralmente requerem diluições maiores.

  3. 0.5μl ponto de amostra / matriz mistura no prato. Um precipitado esbranquiçado formarão na interface entre a camada fina ea gota. Este precipitado é o cocrystallization da matriz e do analito. Quando esta camada cobre o fundo da gota inteiramente, usualiado dentro de 10-15 segundos, aspirar o excesso de líquido com uma linha de vácuo. Se demorar mais de 30 segundos para o precipitado para formar, pode ser uma indicação de um contaminante presente, o que impede a cristalização, ou o seu analito é muito concentrado.

Aplicação de calibração

  1. Prepare a mistura de calibração / matriz de uma forma semelhante, com uma concentração final de calibração entre 0,1-0.5μM.
  2. Local 0.5μl mistura de calibração / matriz sobre a placa em estreita proximidade com os pontos da amostra. Esta proximidade física é usado em um procedimento de calibração pseudo-internas no qual a placa é movido a partir do ponto de amostra para o ponto de calibração durante a aquisição da amostra, para adicionar um disparos de laser alguns dos calibradores para o espectro. Esta abordagem garante uma calibragem maior precisão do que massa de calibração externo.

Lavar passo

  1. Lave cada local, com aproximadamente 2μL de uma solução de TFA 0,1% gelada aquosa. Aspirar o excesso de líquido com uma linha de vácuo.

Aquisição de espectros de massa

  1. Agora você está pronto para adquirir espectros de massa. Se você usar a solução matriz FWI, você deve adquirir o seu espectro o mais rapidamente possível para impedir a modificação irreversível ao analito, tais como formylation.

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References

  1. Xiang, F., Beavis, R. C. A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
  2. Cadene, M., Chait, B. T. A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins. Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).
  3. Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains. J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).

Comments

4 Comments

  1. WHAT ADVANTAGES AND DISADVANTAGES DO MALDI HAVE OVER ELECTRON SPRAY IONIZATION METHOD IN TERMS OF PRECISION,ACCURACY , INSTRUMENTATION AND POSSIBLE INTERFERENCES  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 15, 2008 - 1:34 AM
  2. MALDI, especially with the ultra thin layer method described here, can be use to reliably measure the molecular masses of small quantities of proteins (or protein fragments), even if they are relatively insoluble. For example, the described method allows for the mass spectrometric analysis of intact membrane proteins that are only soluble in the presence of detergents and/or membrane lipids. We have found the procedure to be highly robust for proteins ranging in molecular mass up to as high as 380 kDa. When using electrospray ionization, such measurements can often be quite challenging, especially when only small amounts of protein (sub-picomole) are available and extensive optimization of conditions is not feasible. Mass accuracy in the 100 ppm range is possible in cases where the protein of interest is highly homogenous (see reference ² above).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 23, 2009 - 5:38 PM
  3. Congratulations for this excellent method. I have a doubt about the formic acid concentration. Reference ² describ formic acid reagent at 88% and I think that it was dilute to 1%. Am I right?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 12, 2010 - 3:38 PM
  4. The reagent is indeed Formic Acid, 88% (Certified ACS), Fisher Chemical, as stated in reference ². I think, strictly speaking, the specification that Fisher gives is >=88%.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 12, 2010 - 3:51 PM

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