キメラゼブラフィッシュ胚における網膜と脳の開発のライブイメージングのためのGFP発現割球の移植

Biology

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Summary

我々は、胚発生時のライブイメージング細胞挙動のためのキメラゼブラフィッシュの胚を生成するプロトコルを示しています。

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Zou, J., Wei, X. Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (41), e1924, doi:10.3791/1924 (2010).

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Abstract

細胞は、胚形成の間にその場所とプロパティで広く変わる。これらの変化は、細胞とその環境との相互作用によって調節される。異なる遺伝的背景のセルで構成されているキメラ胚は、、、目的の遺伝子により媒介される細胞間相互作用を研究するための優れたツールです。初期の発達段階におけるゼブラフィッシュの胚の透明性は、細胞レベルでの組織や臓器の形態形成の直接可視化を可能にします。ここで、我々は、ゼブラフィッシュ胚におけるキメラ網膜と脳を生成するために、ドナー細胞のライブイメージングを実行するプロトコルを示しています。プロトコルは、移植針、GFP陰性のホストへのGFP発現ドナー割球の移植、およびライブ共焦点顕微鏡下でドナー細胞の挙動の試験の準備をカバーしています。若干の修正で、このプロトコルはまた、ゼブラフィッシュの他の組織や臓器の胚発生を研究するために使用することができます。ラベルのドナー細胞にGFPを使用する利点についても説明します。

Protocol

1日目。準備

1。魚の交配を設定する

夕方にはゼブラフィッシュのペア十字架を設定します。希望の時間の前にランダムな交配を防ぐために、交配のカセットで、女性と男性の魚を分離する仕切りを使用してください。 GFP -発現するトランスジェニックフィッシュとドナー割球のソースとして使用されます。 pt104トランスジェニックライン(ゾウ 、2008)、ここで使用される、EF1プロモーターの制御下で普遍的にGFPを発現する。 GFPの発現は、ライブイメージングによるドナー細胞の可視化を可能にする。適切な蛍光タンパク質を発現させる他のトランスジェニック魚の行は、特定のニーズに合わせて使用​​することができます。

2。保持する胚のためのくさび形のアガロースの井戸を準備

シャーレにE3卵水(ウェ、2007)で調製した溶融1%アガロースを、、注ぐ。アガロース溶液にくさび状突起を持ち、アガロース溶液が完全に固化させプラスチック金型をフロートさせます。慎重に金型を取り外し、E3水でアガロースのベッドを浸す。

3。移植針を準備

ガラスキャピラリーピペット(世界の精密機器を)引いて針を作るために11.5電力設定で垂直ニードルプラー(デビッドKopfは楽器を)使用してください。良い針先は長いシャフトでテーパーすべき。内径40 -45μmの傾斜開口部が得られるまでマイクログラインダー(Marishige)と45度の角度で針先を挽く(図1A)。針先をクリーンアップするには、吸うと表示されているすべての残骸が削除されるまで10%フッ化水素酸溶液を解放して注射器にホースを接続し、針の平滑末端にホースを取り付け、と。次に、100%エタノール、続いて蒸留水でのヒントを洗う。すべてのエタノールが蒸発するまで針を空気乾燥させる。残留エタノールは、高温の研磨工程の間に針を台無しにする:ヒントが完全に乾いていることを確認することが重要です。針の先端のギザギザを柔らかくし、研磨する、マイクロ捏造(Marishige)のフィラメントによって発生する熱と針の先端を焼く。針の先端が研磨中にフィラメントを接触させてはいけません。フィラメントと針の先端との間のフィラメントとの距離も通過する電気の量は、所望の加熱条件を達成するために調整することができます。温度が高すぎるすべきではない:これは、針の先端を溶融して変形します。粗いエッジが平滑化された後、慎重に針の先端に加熱されたフィラメントに触れ、その後穏やかに先端(図1B)を生成するために針から離れてフィラメントを引き出します。 、シャープな滑らかな、そしてきれいな針はそのままドナー割球を得るためと宿主胚を損傷しないために重要です。

4。胚位置決めプローブを準備

滑らかに端を細いガラスプローブを得るためにガスの炎を介してガラスピペットを引き出します。このプローブは、移植に先立って適切な向きに胚を配置するために使用されます。

2日目。割球移植

1。収集とdechorionate胚

翌日、チームメイトに魚を可能にするクロスカセットに仕切りを削除する。 E3水を満たしたシャーレに胚を置きます。その後、手動で微ピンセットで胚からchorionsを離れて引き裂くことによりdechorionate胚。慎重にアガロースウェルにdechorionated胚を転送するために曲がったシャフトをガラスピペットを使用してください。バーストに胚を引き起こす空気と胚、任意の接触を避ける。胚は28.5で開発℃で3時間後に受精、またはHPFになるまでアガロース井戸でCをしましょう​​。

2。移植装置を設定する

胚が発達しながら、鉱物油で満たされたマイクロポンプシステムへの移植の針を接続することにより、移植装置を設定します。システムがリークされず、空気の泡がシステムの中に閉じ込めされていないことを確認します。先端開口部のスペースを1μl - バック0.5を除いて、ミネラルオイルを全体移植針を埋める。

3。割球の移植

割球を移植する、上方3 - 4 - HPFの胚の割球側をオリエンテーションするガラスの位置決めプローブを使用してください。その後、そっとドナー胚に移植針を挿入し、ゆっくりと針に5〜20割球を吸い上げる。宿主胚に割球を充填した針を挿入し、徐々に割球を離します。彼らの子孫が後の発達段階でローカライズどこ割球がリリースされるサイトが影響します。網膜と脳の発達、動物極でのリリースの細胞を分析する。移植時に、針の先端が空気に接触しないことを確認してください。機械的損傷を最小限に抑えるために、宿主胚は、次の日まで、28.5 ° Cでアガロースのウェルに残されるものとする。次に、t各ウェル内の1つの胚を、1%アガロース、0.5 mlのプレコートした24ウェルプレートにモザイク胚のケース温度。 E3卵の水1 mlを各ウェルに追加されます。細菌感染を防ぐために、E3卵の水に100倍のペニシリンとストレプトマイシンの10μlを加える。

3日目。埋め込みとモザイク胚のライブイメージング

1。埋め込み胚

E3卵の水に1.5%低融点アガロース(LMP)を準備し、30℃の水浴でソリューションを維持。厚さ0.17ミリメートル(世界の精密機器)のグラスの底部とFluoroDish組織培養皿にモザイク胚を移す。ちょうどE3の最小限の量でカバー胚を残すために余分なE3の水分を取り除く。胚30〜50μlを溶かした1.5​​%LMPを追加。アガロース溶液が固化する前に、可能な限り迅速にガラスの底の近くに眼や脳を配置します。解決策が冷却した後、さらに場所の胚を確保するために追加のアガロース溶液を加える。その後、2〜3ミリリットルE3の卵の水で固化したアガロースブ​​ロックを浸す。

2。共焦点像

共焦点顕微鏡の場合は、大規模な焦点深度の水浸反転目標(オリンパス、PlanApo、40 X/0.90 WLSM、日本)が使用されます。水の滴は、客観的に追加して、客観的にFluoroDish組織培養皿を置いています。画像の開発に、胚の写真を撮り、5分ごとにタイムラプスイメージングを行う。実験の性質に応じて、ショットの間の時間間隔を調整する必要があります。

代表的な結果

図2は、代表的な24 - HPFモザイクのゼブラフィッシュを示しています。 GFPの発現は、緑のドナー細胞を強調。網膜神経上皮細胞は網膜の壁の厚さ全体に及ぶ。

映画は24 HPFでのホストの脳におけるドナー細胞の動きを示しています。時間をかけて細胞の形態変化に注目してください。

図1
図1。移植の針先の形状。 A.は、針の先端の斜めの開口部は、フッ酸洗浄後の残骸の自由だ。 B.先端が針の先端に生成されました。

図2
図2。24 HPFにおけるキメラゼブラフィッシュの胚におけるGFP発現ドナー細胞の可視化。左側のパネルには、脳と網膜におけるGFPのシグナルを示しています。中央のパネルには胚の明視野像である。右側のパネルには、マージされた画像を示しています。

映画は1。GFP陽性ドナー細胞のイメージングが開発中の脳の神経上皮細胞の形態には大きな変更を示したライブ。映画の個々のフレームは、24及び25 HPFの間に5 ​​分ごとに収集された。 映画を見るにはここをクリック

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Discussion

このビデオでは、我々はゼブラフィッシュの網膜や脳の発達を分析する割球移植する方法を示しています。このプロトコルはまた、単に、ホスト胚の対応する場所にドナー割球を放出することによって、他の組織や器官の発達を分析するために使用することができます。 GFP分子による標識は、蛍光色素標識デキストラン(ホーとケイン1990)で標識よりクリーンなバックグラウンドをもたらします。死ドナー細胞からデキストランの色素の破片は、このようにイメージング(カタラーノ 、2007)と推測する、GFPよりもはるかに長く続くためです。さらに、GFP陽性ドナー細胞は、デキストランの染料を含有するものよりも健康です。

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Acknowledgments

NIHグラントR01EY016099と盲目のキャリア開発賞を防止する研究:この研究は国立衛生研究所(NIH)コアグラント(5P30EY008098)と、以下の資金XWのによってサポートされていました。我々は、共焦点イメージングにおける援助のためにキラのラスロップに感謝。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 ¾" Glass pipette Fisher Scientific 13-678-30
Borosilicate Glass Capillary World Precision Instruments, Inc. 1B100F-4
FluoroDish World Precision Instruments, Inc. FD35
Vertical Needle / pipette Puller David Kopf Instruments Model 720
Micro Grinder Marishige EG-400
Micro Forge Marishige MF-830
Manual Microsyringe Pump World Precision Instruments, Inc. MMP
Forceps Fine Science Tools 11232-20
Hydrofluoric Acid Fisher Scientific A147-1
Penicillin- Streptomycin GIBCO, by Life Technologies 15140-122
Agarose Research Products International Corp. 9012-36-6
Low melting agarose Fisher Scientific BP165-25

E3 egg water:

  • 5 mM NaCl
  • 0.17 mM KCl
  • 0.33 mM CaCl2
  • 0.33 mM MgSO4
  • 0.1% methylene blue
  • 5 mM NaCl
  • 0.17 mM KCl
  • 0.33 mM CaCl2
  • 0.33 mM MgSO4
  • 0.1% methylene blue
  • 5 mM NaCl
  • 0.17 mM KCl
  • 0.33 mM CaCl2
  • 0.33 mM MgSO4
  • 0.1% methylene blue

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References

  1. Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish. Journal of Neuroscience. 28, (50), 13684-13695 (2008).
  2. Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). THE ZEBRAFISH BOOK. 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).
  3. Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348, 728-730 (1990).
  4. Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina. Developmental Dynamics. 236, (5), 1295-1236 (2007).

Comments

1 Comment

  1. I'm interested in this topic I could watch the videos?

    Thank you

    Mr. Masoud Shirvani

    Reply
    Posted by: Masoud S.
    March 19, 2013 - 4:29 PM

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