जैविक चुंबकीय मॉडुलन biosensing प्रणाली का उपयोग Assays रैपिड सजातीय जांच

Biology

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Summary

चुंबकीय मॉडुलन biosensing प्रणाली के लिए तेजी से, संवेदनशीलता और बस डीएनए अणु और प्रोटीन के रूप में जैविक assays, का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है.

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Danielli, A., Porat, N., Ehrlich, M., Arie, A. Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System. J. Vis. Exp. (40), e1935, doi:10.3791/1935 (2010).

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Abstract

एक चुंबकीय मॉडुलन biosensing प्रणाली (संदेश) [1,2] तेजी से और किसी भी धोने या जुदाई कदम के बिना कम सांद्रता में homogeneously पता चला जैविक लक्ष्य. जब आईएल - आठ लक्ष्य मौजूद थे, 'एक sandwich' आधारित परख आईएल-8 कब्जा एंटीबॉडी के साथ संलग्न चुंबकीय मोतियों आईएल-8 लक्ष्य और एक biotinylated आईएल 8 एंटीबॉडी के माध्यम से युग्मित फ्लोरोसेंट प्रोटीन streptavidin. चुंबकीय मोतियों oscillatory प्रस्ताव में दो विद्युत खंभे के माध्यम से एक बारी चुंबकीय क्षेत्र ढाल लागू करने के द्वारा चतुराई कर रहे हैं. फ्लोरोसेंट प्रोटीन है, जो चुंबकीय मोतियों से जुड़े होते हैं पता लगाने और में और बाहर एक orthogonal लेजर बीम एक आवधिक फ्लोरोसेंट संकेत है कि तुल्यकालिक पता लगाने का उपयोग demodulated है उत्पादन के क्षेत्र में उनके आंदोलन संघनित कर रहे हैं. चुंबकीय मॉडुलन biosensing प्रणाली पहले गैर संरचनात्मक Ibaraki वायरस 3 प्रोटीन (NS3) पूरक डीएनए (सीडीएनए) [2] के कोडन दृश्यों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. तकनीक है कि इस काम में बाह्य और कणों में हेरफेर संक्षेपण के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं अन्य अनुप्रयोगों, जैसे चुंबकीय मिलकर दवाओं के वितरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है

Protocol

आईएल: परख 8

  1. प्रतिक्रिया मिश्रण निम्नलिखित चार घटकों उनके संबंधित सांद्रता में 100 μl परख बफर के अंतिम मात्रा में शामिल है. मोती 100 / μl अंतिम सांद्रता, 2 1 nano-gram/μl अंतिम एकाग्रता पर μl biotinylated आईएल 8 एंटीबॉडी के, 1 20 nano-gram/μl अंतिम एकाग्रता streptavidin फ्लोरोसेंट प्रोटीन के μl पर कब्जा एंटीबॉडी के साथ चुंबकीय मोतियों की 10 μl, और 0.48 pico-gram/μl पर 1 आईएल -8 लक्ष्य के μl. घटकों परख बफर करने के लिए जोड़ा जाता है और फिर 30 मिनट के लिए हिल.
  2. आईएल-8 लक्ष्य बिना एक नियंत्रण प्रतिक्रिया उसी तरह तैयार है.
  3. प्रतिक्रियाओं बाद में किसी भी जुदाई के बिना या cuvettes में धोने कदम रखा जाता है और संदेश प्रणाली का उपयोग कर निरीक्षण किया.

संदेश सिस्टम:

  1. दो विद्युत खंभे के बीच में अपनी स्थिति में क्युवेट रखें.
  2. मॉडुलन वर्तमान प्रचालन और 30 सेकंड प्रतीक्षा करने के लिए एकत्रीकरण और मोतियों की संक्षेपण की अनुमति
  3. लॉक - प्रवर्धक एक आस्टसीलस्कप का उपयोग कर के संकेत उपाय.

प्रतिनिधि परिणाम:

एकत्रित मोतियों के दृश्य निरीक्षण के लक्ष्य के साथ प्रतिक्रिया और लक्ष्य के बिना प्रतिक्रिया के बीच एक स्पष्ट अंतर प्रस्तुत किया. लक्ष्य के साथ सभी प्रतिक्रियाओं में, मोती एक एकल, घने कुल गठन किया कि एकजुट तरीके में लेजर बीम में और बाहर चले गए. हालांकि लक्ष्य के बिना सभी प्रतिक्रिया में, मोती कम एकत्रित थे और उनकी गति कम एकजुट था (चित्रा 1 देखें).

चित्रा 1
चित्रा 1: 'सैंडविच immunoassay के दृश्य (एक) लक्ष्य के बिना निरीक्षण आईएल लक्ष्य आईएल -8 के साथ 8 (ख) .

पोल मॉडुलन (पीला) घड़ी और PMT निर्गम (मैजंटा) संकेत, जबकि 0.48 पिको ग्राम आईएल -8 लक्ष्य का पता लगाने के चित्रा 1 में प्रस्तुत कर रहे हैं (एक). एक पोल के लिए मॉडुलन आवृत्ति 2 हर्ट्ज पर है. हालांकि, के रूप में यह सैद्धांतिक उम्मीद थी, जब मोती लेजर बीम से गुजारें, PMT फ्लोरोसेंट रोशनी का पता लगाता है और वहाँ PMT निर्गम वोल्टेज में एक चोटी है. इसलिए, demodulation आवृत्ति 4 हर्ट्ज पर है. जब PMT संकेत और घड़ी दोगुनी मॉडुलन (4 हर्ट्ज पर) प्रवर्धक में लॉक करने के लिए खिलाया जाता है, संवेदनशील चरण डिटेक्टर तुल्यकालन और उच्च वोल्टेज (देखें चित्र 2) के साथ परिणाम का पता लगाता है.

चित्रा 2
चित्रा 2: (क) मॉडुलन (पीला) घड़ी और PMT (मैजंटा) संकेत का पता लगाने 0.48 जब आईएल-8 पिको ग्राम लक्ष्य. (ख) दो अलग अलग स्कैन प्रवर्धक वोल्टेज के परिणामस्वरूप ताला.

एम्पलीफायर में ताला किसी भी संकेत है जब नियंत्रण नमूना परीक्षण किया गया था पता नहीं लगा था. इस तथ्य को, एकत्रीकरण में दृश्य अंतर के साथ मिलकर पता चलता है कि बोर्ड प्रणाली स्पष्ट रूप से आईएल -8 लक्ष्य की उपस्थिति की पहचान कर सकते हैं.

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Discussion

संक्षेप में, हम पता चला है कि बोर्ड प्रणाली कम सांद्रता (0.5 पिको - ग्राम जैव Plex प्रेसिजन प्रो साइटोकाइन assays [3,4] का पता लगाने सीमा) पर आईएल-8 लक्ष्य की उपस्थिति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रणाली की क्षमता आईएल -8 के लिए सीमित नहीं है और अन्य प्रोटीन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. संदेश - प्रणाली का लाभ लक्ष्य तेजी से और किसी भी अलगाव या वाशिंग कदम के बिना पता लगाने की क्षमता कर रहे हैं. इस प्रकार, यह पता लगाने की प्रक्रिया की सुविधा और प्रणाली क्षेत्र अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया जा के लिए अनुमति देता है.

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Acknowledgements

इस काम आंशिक रूप से Ishaya Horowitz फंड द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bio-Plex Pro Human Cytokine IL-8 set Bio-Rad 171-B5008M
Recombinant human IL-8 target Thermo Fisher Scientific, Inc. R202625
Biotinylated monoclonal mouse anti human IL-8 antibody G265-8 BD Biosciences 554718
Streptavidin coupled fluorescent protein Bio-Rad Streptavidin PE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Danielli, A., Arie, A., Porat, N., Ehrlich, M. Detection of fluorescent-labeled probes at sub-picomolar concentrations by magnetic modulation. Optics Express. 16, 19253-19259 (2008).
  2. Danielli, A., Porat, N., Arie, A., Ehrlich, M. Rapid homogenous detection of the Ibaraki virus NS3 cDNA at pico-molar concentrations by magnetic modulation. Biosensors and Bioelectronics. 25, 858-863 (2009).
  3. Bio-Rad "Human angiogenesis assay panel". Bio-Plex Pro. Forthcoming.
  4. Instruction Manual. Bio-Plex Precision Pro Cytokine Assay. Bio-Rad Laboratories. Hercules, CA. Forthcoming.

Comments

2 Comments

  1. In regards to the IL-8 Assay: [1] Did you have a specific concentration values on hand? [²] Is there a specific pH range that you used? [3] How did you optimize so that the target antigen would bind to both the magnetic bead and the fluorescent protein?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 19, 2010 - 2:26 PM
  2. Hi Michael,
    Here are the answers to your questions:
    [1] Did you have a specific concentration values on hand?

    We made several concentrations according to the Bio-Rad kit that we used. We chose to present the results with the smallest concentration that we made.

    [²] Is there a specific pH range that you used?

    We used the assay buffer of the kit. I guess that it had the optimal ph for the reaction.

    [3] How did you optimize so that the target antigen would bind to both the magnetic bead and the fluorescent protein?

    This kit is optimized already. You may check the reference list of the JoVE manuscript and see the kit&#x²019;s specifications. For further information on the MMB system as well as on the IL-8 kit, I suggest that you look at additional paper that we published: A. Danielli, N. Porat, M. Ehrlich, and A. Arie, &#x²01C;Magnetic modulation biosensing for rapid and homogeneous detection of biological targets at low concentrations&#x²01D;, Current Pharmaceutical Biotechnology, 11, 1²8-137 (²010)

    Best regards,

    Amos Danielli

    Reply
    Posted by: Amos D.
    November 2, 2010 - 3:44 PM

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