Schnelle Homogene Detektion von biologischen Assays mit magnetischen Modulation Biosensorik-System

Biology

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Summary

Magnetic Modulation Biosensorik System wird genutzt, um schnell, feinfühlig und einfach erkennen biologischen Assays, wie DNA-Moleküle und Proteine.

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Danielli, A., Porat, N., Ehrlich, M., Arie, A. Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System. J. Vis. Exp. (40), e1935, doi:10.3791/1935 (2010).

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Abstract

Eine magnetische Modulation Biosensorik System (MMB) [1,2] schnell und homogen erkannt biologischer Targets bei niedrigen Konzentrationen ohne Waschen oder Trennschritt. Wenn die IL-8 Target anwesend war, eine "sandwich'-basierter Assay magnetische Beads mit IL-8 Fänger-Antikörper an gekoppelten fluoreszierenden Proteins über die IL-8 Target und einem biotinylierten IL-8-Antikörper Streptavidin. Die magnetischen Beads werden in schwingende Bewegung durch Anlegen einer Wechselspannung Magnetfeldgradienten durch zwei elektromagnetische Pole manövriert. Die fluoreszierenden Proteine, die den magnetischen Kügelchen befestigt sind, sind in den Erfassungsbereich und ihre Bewegung in und aus einem orthogonalen Laserstrahl erzeugt eine periodische Fluoreszenzsignal, demoduliert mit synchronen Erfassung wird kondensiert. Die magnetische Modulation Biosensoren wurde bereits verwendet, um die kodierenden Sequenzen des nicht-strukturellen Ibaraki Virus-Protein 3 (NS3) komplementäre DNA (cDNA) [2] zu erkennen. Die Techniken, die in dieser Arbeit für externe Manipulation und Kondensation von Teilchen nachgewiesen werden können, für andere Anwendungen, zB Lieferung von magnetisch gekoppelt Drogen verwendet werden

Protocol

IL-8-Assay:

  1. Das Reaktionsgemisch enthalten die folgenden vier Komponenten in 100 ul Endvolumen von Assay-Puffer in ihren jeweiligen Konzentrationen. 10 ul der magnetische Beads mit Capture-Antikörper bei 100 Perlen / ul Endkonzentrationen, 2 ul biotinylierten IL-8-Antikörper bei 1 nano-gram/μl Endkonzentration, 1 ul Streptavidin fluoreszierendes Protein bei 20 nano-gram/μl Endkonzentration, und 1 ul IL-8 Target bei 0,48 pico-gram/μl. Die Komponenten werden nacheinander auf die Assay-Puffer aufgenommen und werden dann für 30 Minuten geschüttelt.
  2. Ein Kontroll-Reaktion ist die gleiche Art und Weise ohne die IL-8 Target vorbereitet.
  3. Die Reaktionen sind später ohne Trenn-oder Waschschritt in die Küvetten gestellt und überprüft mit dem MMB-System.

MMB-System:

  1. Setzen Sie die Küvette in seiner Position zwischen den beiden elektromagnetische Pole.
  2. Betreiben Sie das Modulationsstrom und 30 Sekunden warten, um die Aggregation und Kondensation der Perlen ermöglichen
  3. Messen Sie das Signal des Lock-in-Verstärker mit einem Oszilloskop.

Repräsentative Ergebnisse:

Sichtprüfung der aggregierten Perlen präsentiert einen deutlichen Unterschied zwischen der Reaktion mit dem Ziel und der Reaktion ohne das Ziel. In allen Reaktionen mit dem Ziel, bildete die Perlen einer einzigen dichten Aggregat, das in und aus den Laserstrahl in einem zu vereinen Weise bewegt. Doch in all die Reaktion ohne das Ziel, wurden die Perlen weniger aggregiert und ihre Bewegung war weniger zu vereinen (siehe Abbildung 1).

Abbildung 1
Abbildung 1: Sichtprüfung der Sandwich "-Immunoassay (a), ohne das Ziel IL-8 (b) Mit dem Ziel IL-8.

Der Pol Modulation Uhr (gelb) und die PMT-Ausgangssignal (Magenta) beim Erkennen von 0,48 pico-Gramm-IL-8 Target sind in Abbildung 1 dargestellt (a). Die Modulationsfrequenz für jeden Pol ist mit 2 Hz. Doch wie es theoretisch zu erwarten war, wenn die Perlen der Laserstrahl passieren, erkennt der PMT das Fluoreszenzlicht und es ist ein Spitzenwert in der PMT Ausgangsspannung. Daher ist die Demodulation Frequenz 4 Hz. Wenn die PMT-Signal und das Doppelte-Modulation Uhr (bei 4 Hz), die Sperre im Verstärker gespeist werden, erkennt der sensiblen Phase-Detektor die Synchronisation und die Ergebnisse mit hoher Spannung (siehe Abbildung 2).

Abbildung 2
Abbildung 2: (a) die Modulation Uhr (gelb) und die PMT-Signal (magenta), wenn Erkennung 0,48 pico-Gramm-IL-8 Target. (B) Die Folge lock in-Verstärker Spannung an zwei verschiedenen Scans.

Das Schloss in Verstärker erkannte kein Signal, wenn die Kontrollprobe getestet wurde. Diese Tatsache, zusammen mit den visuellen Unterschied in Aggregation nahe, dass die MMB-System kann eindeutig die Anwesenheit von IL-8 Target.

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Discussion

Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass die MMB-System verwendet werden, um die Anwesenheit von IL-8 Target bei niedrigen Konzentrationen (0,5 pico-Gramm liegt die Nachweisgrenze des Bio-Plex Precision Pro Zytokin-Assays [3,4]) zu erkennen. Die Fähigkeit des Systems ist nicht auf IL-8 begrenzt und kann verwendet werden, um andere Proteine ​​zu erkennen. Die Vorteile des MMB-System sind die Fähigkeit, das Ziel schnell und ohne Trenn-oder Waschschritt zu erkennen. So erleichtert es die Erkennung und ermöglicht dem System, im Feldeinsatz verwendet werden.

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Acknowledgements

Diese Arbeit wurde teilweise durch die Ishaya Horowitz Fund unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bio-Plex Pro Human Cytokine IL-8 set Bio-Rad 171-B5008M
Recombinant human IL-8 target Thermo Fisher Scientific, Inc. R202625
Biotinylated monoclonal mouse anti human IL-8 antibody G265-8 BD Biosciences 554718
Streptavidin coupled fluorescent protein Bio-Rad Streptavidin PE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Danielli, A., Arie, A., Porat, N., Ehrlich, M. Detection of fluorescent-labeled probes at sub-picomolar concentrations by magnetic modulation. Optics Express. 16, 19253-19259 (2008).
  2. Danielli, A., Porat, N., Arie, A., Ehrlich, M. Rapid homogenous detection of the Ibaraki virus NS3 cDNA at pico-molar concentrations by magnetic modulation. Biosensors and Bioelectronics. 25, 858-863 (2009).
  3. Bio-Rad "Human angiogenesis assay panel". Bio-Plex Pro. Forthcoming.
  4. Instruction Manual. Bio-Plex Precision Pro Cytokine Assay. Bio-Rad Laboratories. Hercules, CA. Forthcoming.

Comments

2 Comments

  1. In regards to the IL-8 Assay: [1] Did you have a specific concentration values on hand? [²] Is there a specific pH range that you used? [3] How did you optimize so that the target antigen would bind to both the magnetic bead and the fluorescent protein?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 19, 2010 - 2:26 PM
  2. Hi Michael,
    Here are the answers to your questions:
    [1] Did you have a specific concentration values on hand?

    We made several concentrations according to the Bio-Rad kit that we used. We chose to present the results with the smallest concentration that we made.

    [²] Is there a specific pH range that you used?

    We used the assay buffer of the kit. I guess that it had the optimal ph for the reaction.

    [3] How did you optimize so that the target antigen would bind to both the magnetic bead and the fluorescent protein?

    This kit is optimized already. You may check the reference list of the JoVE manuscript and see the kit&#x²019;s specifications. For further information on the MMB system as well as on the IL-8 kit, I suggest that you look at additional paper that we published: A. Danielli, N. Porat, M. Ehrlich, and A. Arie, &#x²01C;Magnetic modulation biosensing for rapid and homogeneous detection of biological targets at low concentrations&#x²01D;, Current Pharmaceutical Biotechnology, 11, 1²8-137 (²010)

    Best regards,

    Amos Danielli

    Reply
    Posted by: Amos D.
    November 2, 2010 - 3:44 PM

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