免疫組織化学のためのスライス標本の薄いセクショニング

Published 4/28/2007
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Biology

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Summary

本方法は、生検および脳スライスのような小さな、困難な管理するために、組織片、の切片再現可能なクライオスタットを可能にします。我々は日常的に400ミクロン厚の脳スライス5〜10ミクロンの連続切片を生成するために組織の取り扱いと標準クライオスタットを容易にするためにシンプルなアルミの凍結の段階を利用する。

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Park, J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (3), e194, doi:10.3791/194 (2007).

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Abstract

神経科学だけでなく、他の分野の多くの調査は、小規模な勉強を伴う、まだ保存されてきた組織の巨視的な部分またはセクションでは、新鮮な脳組織のスライス標本のように、削除、または摘出が可能なまま。組織サンプルは処理が難しい場合があるので、この物質のその後の顕微鏡的研究は、挑戦することができます。ここで示され、0.2〜5.0ミリメートルの範囲であることが厚さで組織の薄いクリオスタット切片を得る方法です。我々は日常的に50から10ミクロンの冠状クリオスタット切片にシリアルに400ミクロン厚のビブラトームの脳のスライスをカット。スライスは通常、最初のレコーディングが観察されたから、地域の細胞構築の顕微鏡分析を必要として電気生理学的実験に使用しています。我々は、制御および再現性の準備と組織切片の位置決めを可能にするシンプルなデバイスを構築した。このデバイスは、スライスのための凍結段階として機能する1.2センチメートルの直径と長さがシリンダ5センチで構成されています。リングがぴったりと組織が凍結化合物(例えば、OCT)に浸漬できるようにスライスの周りシリンダー提供する壁をスライドさせる。これは、その後すぐに砕いたドライアイスで凍結し、得られたウェーハは、クライオスタットのセクショニングのために容易に位置することができます。薄いセクションでは、することができます雪解けマウントここに示すように、さらなる研究が、in situハイブリダイゼーション、または免疫組織化学では、このような様々な染色法として、実行できるようにするためにコーティングされたスライド上に。

Protocol

  1. OCTのプラットフォーム用のテープから金型を準備します。
  2. OCTで金型を埋める。クライオスタット内や砕いたドライアイスを使用してフリーズ。
  3. 冷凍のOCTプラットフォームの周りのテープをはがします。
  4. 凍結チャックとクライオスタットチャックの載置台と、ロックオンマークを合わせます。
  5. 表面までのOCTのプラットフォームを通じて、セクションはフラットです。
  6. クライオスタットの冷凍の段階で再舗装OCTのプラットフォームと場所を削除します。
  7. OCTでの場所の組織サンプル(以前PBSで30%グリセロールまたはショ糖を凍結保存)。
  8. 外輪は、OCTのためにも形成する列の最上部より上に5mm程度突出して凍結列を準備します。
  9. 慎重に凍結カラム表面の中央に位置組織サンプルを、十分に満たされるまでゆっくりとOCTを追加。
  10. 砕いたドライアイスで凍結列を囲みます。組織とOCTは完全に20〜60秒以内に凍結してください。
  11. サンプルが凍結したまま温度の準備が増加するにつれて、外輪は削除することができます。
  12. 凍結列の横とクライオスタット内の場所から試料をスライドさせます。
  13. OCTのプラットフォームと会社の圧力を適用する位置の試料(組織ダウン)の表面上に、OCTの代わりに降下。試料は、速やかにOCTのプラットフォームの上にフリーズします。
  14. 整列マークでステージをマウントするクライオスタットにチャックを固定します。
  15. 組織標本の表面的なOCTの断面。
  16. ガラススライド上に薄いセクションをマウントし、冷凍または室温で保存解凍。
  17. 免疫反応は、スライドガラスにマウントされている組織のために行うことができます。
  18. 試薬をスライド上にプールされ、穏やかに撹拌することができ、光に敏感な場合の対象となる場合があります。
  19. 反応のその後のステージは、簡単にスライドをウィッキング、廃棄物の容器に反転スライドによって実行し、次の試薬を適用しています。

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Discussion

ここで紹介するプロトコルは、と研究者を提供する、簡潔で分かりやすいなどなど、実行する、さらなる研究のための生検および脳スライスのような小さな、困難な管理するために、組織片を、、の薄いクリオスタット切片を入手する方法の概要をin situハイブリダイゼーション、または免疫組織化学における様々な染色法、。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
O. C. T. Ted Pella, Inc. 27050
Glycerol Solution 30% Glycerol Solution in PBS w/v
Sucrose Solution 30% Sucrose Solution in PBS w/v

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scoutern, C. W., O'Connor, R., Cunningham, M. Perfusion fixation of research animals. Microsc. Today. 14, 26-33 (2006).
  2. Cunningham, M. G., Connor, C. M., Zhang, K., Benes, F. M. Diminished serotonergic innervation of adult medial prefrontal cortex after 6-OHDA lesions in the newborn rat. Brain Res. Dev. Brain Res. 157, 124-131 (2005).

Comments

3 Comments

  1. Thank-you for posting this video. Your device seems to work well with small tissue, but what do you use for freezing whole adult rat brains? Is the powdered dry ice method sufficient alone to reduce freezing artifact if you are freezing a whole adult brain? Do you have an alternative procedure for these applications?   Much appreciated,
    Neil

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 23, 2008 - 4:04 AM
  2. Hi Neil, you actually can get a pretty good freeze with finely powdered dry ice. Just cover and let freeze for 3-5 minutes.  I would recommend, however, immersing the whole brain in isopentane that has been chilled (~30 minutes) in dry ice.  Just leave the brain in isopentane for 30 seconds, otherwise it can distort and fracture.  You will then need to let the (very cold, -80 degrees) brain equilibrate (warm up) to your cryostat or microtome temperature in order for it to cut smoothly.
    Good luck!
    Miles

    Miles G. Cunningham, MD PhD
    Director, Laboratory for Neural Reconstruction
    Administrative Director, McLean Fellowship in
    Neuropsychiatry and Behavioral Neurology
    Chair, ANPA Programs Committee
    Executive Director, Asniya, Inc.
    MRC 333, McLean Hospital
    Harvard Medical School
    115 Mill Street
    Belmont, MA  0²478
    office:     617.855.²051
    fax:         617.855.3199
    page:      617.855.²000

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 24, 2008 - 5:18 PM
  3. Thanks for this very helpful video. I'm interested in knowing where you purchased the freezing rod and ring that is used to form the sample mold. Alternatively what metal is the rod made of and is there any significance to the length of the freezing rod used?

    Reply
    Posted by: Ellen Y.
    April 23, 2010 - 3:57 PM

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