El corte delgado de los preparativos de círculo para inmunohistoquímica

Published 4/28/2007
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Biology

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Summary

El presente método permite criostato reproducible la sección de los pequeños trozos de tejido, difícil de manejar, tales como las biopsias y las rodajas de cerebro. Utilizamos una etapa de aluminio de congelación sencillo para facilitar la manipulación de los tejidos y un criostato de rutina estándar para producir secciones 5-10 micrones de serie a partir de 400 rebanadas de cerebro micras de espesor.

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Park, J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (3), e194, doi:10.3791/194 (2007).

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Abstract

Muchas investigaciones de la neurociencia, así como otras disciplinas, implican el estudio pequeño, pero las piezas macroscópicas o secciones de tejido que se han conservado, recién retirado, o eliminado, pero mantuvo viable, como en los preparativos trozo de tejido cerebral. Posteriores estudios microscópicos de este material puede ser un reto, ya que las muestras de tejido puede ser difícil de manejar. Demostrado aquí es un método para la obtención de secciones delgadas criostato de tejido con un espesor que puede variar 0,2-5,0 mm. En forma rutinaria cortar 400 micrones de espesor rebanadas de cerebro Vibratome serie en secciones 10/05 micras criostato coronal. Los cortes son generalmente utilizado por primera vez para los experimentos de electrofisiología y requieren de un análisis microscópico de la citoarquitectura de la región de la que las grabaciones fueron observados. Hemos construido un sencillo dispositivo que permite la preparación controlada y reproducible y la colocación de la lámina de tejido. Este dispositivo consiste en un cilindro de 5 cm de longitud con un diámetro de 1,2 cm, que sirve como una etapa de congelación de la división. Un anillo perfectamente se desliza sobre las paredes del cilindro proporcionando alrededor de la porción permite que el tejido se sumerge en el complejo de congelación (por ejemplo, octubre). Esto es luego rápidamente congelados con hielo seco triturado y la oblea resultante puede ser fácilmente la posición de seccionamiento criostato. Secciones delgadas se pueden descongelar montados en portaobjetos recubiertos para permitir estudios a realizar, tales como diversos métodos de tinción, hibridación in situ, o inmunohistoquímica, como se muestra aquí.

Protocol

  1. Prepare el molde de la cinta para la plataforma de octubre
  2. Colocar el molde con octubre Congelar en criostato o mediante el uso de hielo seco triturado.
  3. Retire la cinta de todo congelado plataforma de octubre
  4. Alinear las marcas de tenazas de congelación y la etapa de montaje criostato y el bloqueo en el mandril.
  5. Sección a través de la plataforma octubre hasta que la superficie es plana.
  6. Quitar resurgió plataforma octubre y el lugar en el escenario de congelación criostato.
  7. Colocar la muestra de tejido (previamente criopreservados con 30% de glicerol o sacarosa en PBS) en octubre
  8. Preparar la columna de congelación con anillo exterior sobresale alrededor de 5 mm por encima de la parte superior de la columna formando bien para octubre
  9. Cuidadosamente la posición de muestra de tejido en el centro de la superficie de la columna de congelación y agregue lentamente octubre hasta el pozo se llena.
  10. Rodean la columna de congelación con hielo seco triturado. Tejido y octubre debería congelar completamente dentro de 20-60 segundos.
  11. A medida que aumenta la preparación de la temperatura, el anillo exterior se puede quitar, mientras que la muestra permanece congelado.
  12. Diapositivas de muestra de la columna hacia un lado la congelación y el lugar en el criostato.
  13. Coloque una gota de octubre en la superficie de la plataforma de octubre y muestra la posición (el tejido hacia abajo) aplicando una presión firme. Espécimen se congela rápidamente en la plataforma octubre
  14. Seguro manguito a criostato montaje escenario con alineación de las marcas.
  15. Sección a través de octubre superficial de la muestra de tejido.
  16. Descongele montaje de secciones delgadas en portaobjetos de vidrio y guardar congelados oa temperatura ambiente.
  17. Inmunoreacciones se puede realizar para el tejido montados en portaobjetos de vidrio.
  18. Reactivo se reunieron en la diapositiva, se puede agitar suavemente, y puede ser cubierto en caso de sensible a la luz.
  19. Las etapas posteriores de la reacción se realiza fácilmente por diapositivas invirtiendo en el receptáculo de residuos, que absorbe la diapositiva, y luego aplicar el siguiente reactivo.

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Discussion

El protocolo que aquí se presenta ofrece a los investigadores con un conciso y fácil de seguir, resumen de cómo obtener secciones delgadas criostato de pequeños trozos de tejido, difícil de manejar, tales como las biopsias y las rodajas de cerebro de más estudios para llevar a cabo, tales como diversos métodos de tinción, hibridación in situ, o inmunohistoquímica.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
O. C. T. Ted Pella, Inc. 27050
Glycerol Solution 30% Glycerol Solution in PBS w/v
Sucrose Solution 30% Sucrose Solution in PBS w/v

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scoutern, C. W., O'Connor, R., Cunningham, M. Perfusion fixation of research animals. Microsc. Today. 14, 26-33 (2006).
  2. Cunningham, M. G., Connor, C. M., Zhang, K., Benes, F. M. Diminished serotonergic innervation of adult medial prefrontal cortex after 6-OHDA lesions in the newborn rat. Brain Res. Dev. Brain Res. 157, 124-131 (2005).

Comments

3 Comments

  1. Thank-you for posting this video. Your device seems to work well with small tissue, but what do you use for freezing whole adult rat brains? Is the powdered dry ice method sufficient alone to reduce freezing artifact if you are freezing a whole adult brain? Do you have an alternative procedure for these applications?   Much appreciated,
    Neil

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 23, 2008 - 4:04 AM
  2. Hi Neil, you actually can get a pretty good freeze with finely powdered dry ice. Just cover and let freeze for 3-5 minutes.  I would recommend, however, immersing the whole brain in isopentane that has been chilled (~30 minutes) in dry ice.  Just leave the brain in isopentane for 30 seconds, otherwise it can distort and fracture.  You will then need to let the (very cold, -80 degrees) brain equilibrate (warm up) to your cryostat or microtome temperature in order for it to cut smoothly.
    Good luck!
    Miles

    Miles G. Cunningham, MD PhD
    Director, Laboratory for Neural Reconstruction
    Administrative Director, McLean Fellowship in
    Neuropsychiatry and Behavioral Neurology
    Chair, ANPA Programs Committee
    Executive Director, Asniya, Inc.
    MRC 333, McLean Hospital
    Harvard Medical School
    115 Mill Street
    Belmont, MA  0²478
    office:     617.855.²051
    fax:         617.855.3199
    page:      617.855.²000

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 24, 2008 - 5:18 PM
  3. Thanks for this very helpful video. I'm interested in knowing where you purchased the freezing rod and ring that is used to form the sample mold. Alternatively what metal is the rod made of and is there any significance to the length of the freezing rod used?

    Reply
    Posted by: Ellen Y.
    April 23, 2010 - 3:57 PM

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