Immunohistochemistry के लिए स्लाइस तैयारी की पतली सेक्शनिंग

Published 4/28/2007
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Biology

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Summary

वर्तमान विधि छोटे मुश्किल का प्रबंधन करने के लिए, जैसे ऊतक के टुकड़े, बायोप्सी और मस्तिष्क स्लाइसें की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य cryostat सेक्शनिंग अनुमति देता है. हम एक सरल एल्यूमीनियम ठंड चरण के लिए ऊतक की हैंडलिंग और एक मानक के लिए नियमित रूप से 400 माइक्रोन मोटी मस्तिष्क स्लाइसें में से 5-10 माइक्रोन धारावाहिक वर्गों उत्पादन cryostat की सुविधा का उपयोग.

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Park, J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (3), e194, doi:10.3791/194 (2007).

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Abstract

तंत्रिका विज्ञान, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य विषयों में कई जांच, छोटे अध्ययन शामिल है, अभी तक macroscopic टुकड़े या ऊतक के वर्गों, कि संरक्षित किया गया है हौसले से हटाया, या excised लेकिन व्यवहार्य रखा के रूप में मस्तिष्क के ऊतकों का टुकड़ा तैयारी में,. इस सामग्री के बाद सूक्ष्म अध्ययन, चुनौतीपूर्ण हो सकता है के रूप में ऊतकों के नमूनों को संभालना मुश्किल हो सकता है. यहाँ का प्रदर्शन किया मोटाई 0.2-5.0 मिमी से लेकर सकता है के साथ ऊतक की पतली cryostat वर्गों को प्राप्त करने के लिए एक विधि है. हम नियमित रूप से 400 माइक्रोन मोटी Vibratome मस्तिष्क स्लाइसें serially 5-10 माइक्रोन राज्याभिषेक cryostat वर्गों में कटौती. स्लाइस आम तौर पर कर रहे हैं पहली बार इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया और तब क्षेत्र है जिसमें से रिकॉर्डिंग मनाया गया cytoarchitecture के सूक्ष्म विश्लेषण की आवश्यकता है. हम एक सरल युक्ति है कि नियंत्रित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तैयारी और ऊतकों टुकड़ा की स्थिति की अनुमति देता है का निर्माण किया है. इस डिवाइस 1.2 सेमी की एक व्यास है, जो टुकड़ा के लिए एक ठंड चरण के रूप में कार्य करता है के साथ एक सिलेंडर 5 सेमी लंबाई में होते हैं. एक अंगूठी snugly अनुमति ऊतक ठंड परिसर में विसर्जित करने के लिए (उदाहरण के लिए, अक्टूबर) टुकड़ा भर सिलेंडर प्रदान दीवारों पर स्लाइड. यह तो जल्दी कुचल सूखी बर्फ के साथ जमे हुए और जिसके परिणामस्वरूप वफ़र स्थिति cryostat सेक्शनिंग के लिए आसानी से किया जा सकता है. पतला वर्गों जा सकता पिघलना घुड़सवार लेपित स्लाइड्स पर ऐसे विभिन्न धुंधला तरीके के रूप में में आगे के अध्ययन किया जा करने के लिए, स्वस्थानी संकरण, या immunohistochemistry में, जैसा कि यहाँ प्रदर्शन की अनुमति है.

Protocol

  1. अक्टूबर मंच के लिए टेप से मोल्ड तैयार करें.
  2. अक्टूबर के साथ मोल्ड भरें. Cryostat के भीतर या कुचल सूखी बर्फ का उपयोग करके रुक.
  3. जमी अक्टूबर मंच के आसपास से टेप निकालें.
  4. ठंड चक और cryostat बढ़ते चरण और चक में ताला पर निशान संरेखित करें.
  5. सतह जब तक अक्टूबर मंच के माध्यम से धारा फ्लैट है.
  6. Cryostat ठंड मंच पर बार फिर जाग उठा अक्टूबर मंच और जगह निकालें.
  7. प्लेस अक्टूबर में ऊतक का नमूना (पहले 30% या पीबीएस में ग्लिसरॉल sucrose के साथ cryopreserved).
  8. बाहरी रिंग अक्टूबर के लिए अच्छी तरह से बनाने के स्तंभ के शीर्ष के ऊपर 5 मिमी के बारे में पेश करने के साथ ठंड स्तंभ तैयार करें.
  9. ध्यान से ठंड स्तंभ सतह के केंद्र पर ऊतक का नमूना स्थिति और धीरे अक्टूबर जोड़ने जब तक अच्छी तरह से भर जाता है.
  10. कुचल शुष्क बर्फ के साथ ठंड स्तंभ चारों ओर. ऊतक और अक्टूबर 20-60 सेकंड के भीतर पूरी तरह से फ्रीज चाहिए.
  11. तापमान में तैयारी बढ़ जाती है के रूप में, बाहरी रिंग जबकि नमूना जमे हुए रहता है हटाया जा सकता है.
  12. ठंड स्तंभ बग़ल में और cryostat में जगह बंद नमूना स्लाइड.
  13. अक्टूबर के अक्टूबर मंच और स्थिति (नीचे ऊतक) नमूना फर्म दबाव लागू करने की सतह पर प्लेस ड्रॉप. नमूना जल्दी अक्टूबर मंच पर फ्रीज होगा.
  14. Cryostat पर सुरक्षित चक गठबंधन के निशान के साथ बढ़ते चरण.
  15. अक्टूबर के माध्यम से ऊतक के नमूने के लिए सतही धारा.
  16. माउंट गिलास स्लाइड पर पतली वर्गों और जमे हुए या कमरे के तापमान पर स्टोर पहले गला लें.
  17. Immunoreactions गिलास स्लाइड पर घुड़सवार ऊतक के लिए किया जा सकता है है.
  18. अभिकर्मक स्लाइड पर जमा है, धीरे उत्तेजित किया जा सकता है है, और प्रकाश के प्रति संवेदनशील अगर कवर किया जा सकता है.
  19. प्रतिक्रिया के बाद के चरणों आसानी से बर्बाद गोदाम में inverting स्लाइड द्वारा प्रदर्शन किया, wicking स्लाइड, और फिर अगले अभिकर्मक आवेदन.

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Discussion

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल के साथ प्रदान करता है शोधकर्ताओं के एक संक्षिप्त, आसान करने के लिए कैसे प्राप्त करने के लिए छोटे मुश्किल का प्रबंधन करने के लिए, और प्रदर्शन किया जा करने के लिए आगे के अध्ययन के लिए बायोप्सी और मस्तिष्क स्लाइसें जैसे ऊतक के टुकड़े, इस तरह के रूप में, पतली cryostat वर्गों की रूपरेखा का पालन करें स्वस्थानी संकरण, या immunohistochemistry में विभिन्न धुंधला विधियों,.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
O. C. T. Ted Pella, Inc. 27050
Glycerol Solution 30% Glycerol Solution in PBS w/v
Sucrose Solution 30% Sucrose Solution in PBS w/v

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scoutern, C. W., O'Connor, R., Cunningham, M. Perfusion fixation of research animals. Microsc. Today. 14, 26-33 (2006).
  2. Cunningham, M. G., Connor, C. M., Zhang, K., Benes, F. M. Diminished serotonergic innervation of adult medial prefrontal cortex after 6-OHDA lesions in the newborn rat. Brain Res. Dev. Brain Res. 157, 124-131 (2005).

Comments

3 Comments

  1. Thank-you for posting this video. Your device seems to work well with small tissue, but what do you use for freezing whole adult rat brains? Is the powdered dry ice method sufficient alone to reduce freezing artifact if you are freezing a whole adult brain? Do you have an alternative procedure for these applications?   Much appreciated,
    Neil

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 23, 2008 - 4:04 AM
  2. Hi Neil, you actually can get a pretty good freeze with finely powdered dry ice. Just cover and let freeze for 3-5 minutes.  I would recommend, however, immersing the whole brain in isopentane that has been chilled (~30 minutes) in dry ice.  Just leave the brain in isopentane for 30 seconds, otherwise it can distort and fracture.  You will then need to let the (very cold, -80 degrees) brain equilibrate (warm up) to your cryostat or microtome temperature in order for it to cut smoothly.
    Good luck!
    Miles

    Miles G. Cunningham, MD PhD
    Director, Laboratory for Neural Reconstruction
    Administrative Director, McLean Fellowship in
    Neuropsychiatry and Behavioral Neurology
    Chair, ANPA Programs Committee
    Executive Director, Asniya, Inc.
    MRC 333, McLean Hospital
    Harvard Medical School
    115 Mill Street
    Belmont, MA  0²478
    office:     617.855.²051
    fax:         617.855.3199
    page:      617.855.²000

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 24, 2008 - 5:18 PM
  3. Thanks for this very helpful video. I'm interested in knowing where you purchased the freezing rod and ring that is used to form the sample mold. Alternatively what metal is the rod made of and is there any significance to the length of the freezing rod used?

    Reply
    Posted by: Ellen Y.
    April 23, 2010 - 3:57 PM

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