Immunohistochemistry에 대한 슬라이스 준비 씬 Sectioning

Published 4/28/2007
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Biology

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Summary

현재의 방법은 같은 biopsies 및 뇌 조각과 같은 작은 어려운 관리, 조직 조각의 sectioning 재현할 그라 이오 스탯 수 있습니다. 우리는 조직의 처리와 정기적으로 400 미크론 두께의 뇌 조각 5-10 미크론 시리얼 섹션을 생성하는 표준 그라 이오 스탯을 촉진하기 위하여 간단한 알루미늄 동결 단계를 활용.

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Park, J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (3), e194, doi:10.3791/194 (2007).

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Abstract

신경 과학뿐만 아니라 다른 분야의 많은 조사는 작은 공부 관련, 아직 보존되어있다 조직의 매크로 조각이나 섹션, 갓 뇌 조직 슬라이스 준비에서와 같이, 제거, 또는 excised하지만 가능한 있었죠. 조직 샘플은 처리하기 어려울 수 있으므로이 물질의 미세한 후속 연구, 도전하실 수 있습니다. 여기서 보여주는 0.2-5.0 mm의 범위 수있는 두께로 조직의 얇은 그라 이오 스탯 섹션을 얻기위한 방법입니다. 우리는 일상적으로 5-10 미크론 코로나 그라 이오 스탯 섹션에 순차적으로 400 미크론 두께 Vibratome 뇌 조각 했네요. 조각은 일반적으로 첫번째 전기 생리학 실험에 사용되는 다음 레코딩이 관찰되었다하는 지역의 cytoarchitecture의 미세 분석을 요구하고 있습니다. 우리는 통제하고 재현할 준비 및 조직 슬라이스의 위치를​​ 수있는 간단한 장치를 건설했습니다. 본 장치는 슬라이스에 대한 동결 무대의 역할 1.2 cm의 직경과 길이 실린더 5cm로 구성되어 있습니다. 반지는 snugly 조직 (예, 10 월) 냉동 화합물에 포장되어 수 있도록 슬라이스 주변의 실린더 벽 제공하는 이상의 슬라이드. 이것은 그때 신속하게 조각 드라이 아이스와 냉동이고 결과 웨이퍼는 그라 이오 스탯의 sectioning에 대해 쉽게 위치를하실 수 있습니다. 얇은 섹션 수있는 해동 장착 여기 시연으로 더 연구가, 현장 하이브리드화, 또는 immunohistochemistry에서 각종 얼룩 방법으로 수행할 수 있도록 코팅 슬라이드에.

Protocol

  1. OCT 플랫폼 테이프에서 금형을 준비합니다.
  2. OCT와 금형을 입력합니다. 그라 이오 스탯 내에서 또는 조각 드라이 아이스를 사용하여 고정.
  3. 냉동 OCT 플랫폼 주변에서 테이프를 제거합니다.
  4. 냉동 척하고 그라 이오 스탯 장착 무대와 척의 잠금에 대한 점수를 맞춥니다.
  5. 표면까지 OCT 플랫폼을 통해 섹션 평면이다.
  6. 그라 이오 스탯 동결 단계에서 재부 상 OCT 플랫폼과 장소를 제거합니다.
  7. OCT에서 개최 조직 샘플 (이전 PBS에 30 % 글리세롤이나 자당과 cryopreserved).
  8. 외륜은 OCT를 잘 형성 열의 맨 위에 5mm에 대한 예상과 동결 컬럼을 준비합니다.
  9. 조심스럽게 냉동 열 표면의 중심에 위치 조직 샘플을 잘 채워 때까지 천천히 OCT를 추가합니다.
  10. 조각 드라이 아이스와 냉동 열을 서라운드. 조직 및 OCT 완전히 20-60 초 이내에 정지한다.
  11. 샘플 냉동 유지하면서 온도의 준비를 증가로서, 외륜을 제거할 수 있습니다.
  12. 냉동 열 측면과 그라 이오 스탯의 장소에서 샘플을 슬라이드.
  13. OCT 플랫폼과 기업의 압력을 적용 위치 표본 (조직 아래)의 표면에 OCT의 플레이스 놓습니다. 스피스먼 신속하게 OCT 플랫폼에 정지합니다.
  14. 그라 이오 스탯에 보안 척 정렬 부호 무대를 장착.
  15. 조직 표본을 외면 OCT를 통해 섹션을 참조하십시오.
  16. 유리 슬라이드에 얇은 섹션을 탑재하고 냉동 또는 실온에서 해동 저장.
  17. Immunoreactions은 유리 슬라이드에 장착된 조직에 대해 수행할 수 있습니다.
  18. 시약은 슬라이드로 풀링됩니다 부드럽게 흥분 수 있으며, 조명에 민감한 경우 적용 수 있습니다.
  19. 반응의 후속 단계는 쉽게 슬라이드를 위킹, 폐기물 콘센트에 반전 슬라이드에서 수행하고 다음 시약을 적용하고 있습니다.

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Discussion

여기에 제시 프로토콜과 연구자를 제공하는 간결한, 쉬운 따라 같은 같은 수행을 추가 연구를위한 biopsies 및 뇌 조각과 같은 작은 어려운 관리, 조직 조각, 얇은 그라 이오 스탯 섹션을 구하는 방법의 개요를 원위치 하이브리드화, 또는 immunohistochemistry 다양한 얼룩 방법.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
O. C. T. Ted Pella, Inc. 27050
Glycerol Solution 30% Glycerol Solution in PBS w/v
Sucrose Solution 30% Sucrose Solution in PBS w/v

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scoutern, C. W., O'Connor, R., Cunningham, M. Perfusion fixation of research animals. Microsc. Today. 14, 26-33 (2006).
  2. Cunningham, M. G., Connor, C. M., Zhang, K., Benes, F. M. Diminished serotonergic innervation of adult medial prefrontal cortex after 6-OHDA lesions in the newborn rat. Brain Res. Dev. Brain Res. 157, 124-131 (2005).

Comments

3 Comments

  1. Thank-you for posting this video. Your device seems to work well with small tissue, but what do you use for freezing whole adult rat brains? Is the powdered dry ice method sufficient alone to reduce freezing artifact if you are freezing a whole adult brain? Do you have an alternative procedure for these applications?   Much appreciated,
    Neil

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 23, 2008 - 4:04 AM
  2. Hi Neil, you actually can get a pretty good freeze with finely powdered dry ice. Just cover and let freeze for 3-5 minutes.  I would recommend, however, immersing the whole brain in isopentane that has been chilled (~30 minutes) in dry ice.  Just leave the brain in isopentane for 30 seconds, otherwise it can distort and fracture.  You will then need to let the (very cold, -80 degrees) brain equilibrate (warm up) to your cryostat or microtome temperature in order for it to cut smoothly.
    Good luck!
    Miles

    Miles G. Cunningham, MD PhD
    Director, Laboratory for Neural Reconstruction
    Administrative Director, McLean Fellowship in
    Neuropsychiatry and Behavioral Neurology
    Chair, ANPA Programs Committee
    Executive Director, Asniya, Inc.
    MRC 333, McLean Hospital
    Harvard Medical School
    115 Mill Street
    Belmont, MA  0²478
    office:     617.855.²051
    fax:         617.855.3199
    page:      617.855.²000

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 24, 2008 - 5:18 PM
  3. Thanks for this very helpful video. I'm interested in knowing where you purchased the freezing rod and ring that is used to form the sample mold. Alternatively what metal is the rod made of and is there any significance to the length of the freezing rod used?

    Reply
    Posted by: Ellen Y.
    April 23, 2010 - 3:57 PM

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