Sectioning رقيقة من الاستعدادات لشريحة المناعية

Published 4/28/2007
3 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

الأسلوب الحالي يسمح ناظم البرد استنساخه sectioning قطعة صغيرة من الأنسجة ، ويصعب إدارتها ، مثل الخزعات وشرائح الدماغ. علينا الاستفادة من مرحلة التجميد الألومنيوم بسيطة لتسهيل التعامل مع الأنسجة وناظم البرد القياسية لانتاج المقاطع بشكل روتيني 5-10 ميكرون المسلسل من شرائح 400 ميكرون سميكة الدماغ.

Cite this Article

Copy Citation

Park, J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (3), e194, doi:10.3791/194 (2007).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

العديد من التحقيقات في علم الأعصاب ، وكذلك التخصصات الأخرى ، وتشمل دراسة صغيرة ، وبعد قطع العيانية أو أجزاء من الأنسجة التي تم الحفاظ عليها ، إزالة طازجة ، أو رفعه لكنها أبقت قابلة للحياة ، كما هو الحال في الأعمال التحضيرية شريحة من أنسجة المخ. ويمكن لدراسات لاحقة المجهرية لهذه المواد يمكن أن يكون تحديا ، حيث أن عينات الأنسجة قد يكون من الصعب التعامل معها. تظاهر هنا هو وسيلة للحصول على مقاطع رقيقة من نسيج ناظم البرد بسماكة التي قد تتراوح 0،2-5،0 مم. نقطع بشكل روتيني 400 ميكرون سميكة شرائح الدماغ Vibratome متسلسل إلى أقسام ميكرون ناظم البرد الاكليلية 5-10. وعادة ما تكون شرائح استخدم لأول مرة للتجارب الكهربية وتتطلب ثم تحليل مجهري للالتهندس الخلوي في المنطقة التي لوحظت من التسجيلات. لقد وضعنا جهاز بسيط هو أن يسمح للرقابة واعداد المواقع واستنساخه من شريحة الأنسجة. هذا الجهاز يتكون من اسطوانة 5 سم في الطول التي يبلغ قطرها 1.2 سم ، والتي هي بمثابة مرحلة تجميد للشريحة. حلقة الشرائح بشكل مريح على جدران الاسطوانة توفير حول السماح لشريحة تكون مغمورة في النسيج المركب تجميد (على سبيل المثال ، أكتوبر). ثم يتم تجميدها بسرعة مع هذا الثلج الجاف المسحوق والرقاقة يمكن أن يؤدي بسهولة لموقف sectioning ناظم البرد. يمكن أن تكون رقيقة أقسام أذاب محمولة على الشرائح المغلفة للسماح تنفيذ المزيد من الدراسات ، مثل أساليب التلوين المختلفة ، والتهجين في الموقع ، أو المناعية ، كما يتضح هنا.

Protocol

  1. إعداد قالب من الشريط لمنصة أكتوبر
  2. ملء القالب مع أكتوبر تجميد داخل ناظم البرد أو باستخدام الثلج الجاف سحقهم.
  3. إزالة الشريط من حول منصة أكتوبر المجمدة.
  4. محاذاة علامات على تجميد وتشاك المرحلة ناظم البرد في تصاعد وقفل تشوك.
  5. المقطع من خلال منصة أكتوبر حتى سطح مسطح.
  6. إزالة أكتوبر منصة الظهور على خشبة المسرح ومكان تجميد ناظم البرد.
  7. مكان عينة الأنسجة (cryopreserved سابقا مع الجلسرين 30 ٪ سكروز أو في برنامج تلفزيوني) في أكتوبر
  8. تعد العمود الدائرى مع تجميد إسقاط حوالي 5 مم فوق رأس العمود جيدا لتشكيل أكتوبر
  9. الموقف بعناية عينات الأنسجة على سطح مركز العمود تجميد وإضافة ببطء حتى أكتوبر جيدا هو شغلها.
  10. تحيط تجميد العمود مع الثلج الجاف سحقهم. وينبغي تجميد الأنسجة وأكتوبر تماما في غضون ثوان 20-60.
  11. كما يزيد من درجة الحرارة في التحضير ، يمكن إزالة الطوق الخارجي ، بينما لا تزال مجمدة العينة.
  12. الشريحة العينة جانبية تجميد العمود ووضعه في ناظم البرد.
  13. انخفاض مكان على سطح أكتوبر من منصة أكتوبر وموقف عينة (نسيج أسفل) الضغط الشركة. سوف تجميد العينات بسرعة على منصة أكتوبر
  14. تشوك آمن على خشبة المسرح مع تصاعد ناظم البرد علامات الانحياز.
  15. من خلال المقطع أكتوبر سطحية في عينة الأنسجة.
  16. ذوبان جبل المقاطع رقيقة على الشرائح الزجاجية وتخزينها أو المجمدة في درجة حرارة الغرفة.
  17. لا يمكن أن يؤديها Immunoreactions للأنسجة التي شنت على الشرائح الزجاجية.
  18. غير مجمعة كاشف على الشريحة ، ويمكن تحريكها بلطف ، ويمكن تغطيتها اذا حساسة للضوء.
  19. يتم تنفيذ المراحل اللاحقة بسهولة من رد فعل من جانب الشريحة عكس في وعاء النفايات ، فتل الشريحة ، ثم تطبيق الكاشف المقبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بروتوكول المعروضة هنا يقدم الباحثون مع موجزة وسهلة لمتابعة الخطوط العريضة لكيفية الحصول على المقاطع ناظم البرد رقيقة من القطع الصغيرة الأنسجة ، ويصعب إدارتها ، مثل الخزعات وشرائح الدماغ لمزيد من الدراسات التي يتعين القيام بها ، مثل طرق التلوين المختلفة ، في الموقع التهجين ، أو المناعية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
O. C. T. Ted Pella, Inc. 27050
Glycerol Solution 30% Glycerol Solution in PBS w/v
Sucrose Solution 30% Sucrose Solution in PBS w/v

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scoutern, C. W., O'Connor, R., Cunningham, M. Perfusion fixation of research animals. Microsc. Today. 14, 26-33 (2006).
  2. Cunningham, M. G., Connor, C. M., Zhang, K., Benes, F. M. Diminished serotonergic innervation of adult medial prefrontal cortex after 6-OHDA lesions in the newborn rat. Brain Res. Dev. Brain Res. 157, 124-131 (2005).

Comments

3 Comments

  1. Thank-you for posting this video. Your device seems to work well with small tissue, but what do you use for freezing whole adult rat brains? Is the powdered dry ice method sufficient alone to reduce freezing artifact if you are freezing a whole adult brain? Do you have an alternative procedure for these applications?   Much appreciated,
    Neil

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 23, 2008 - 4:04 AM
  2. Hi Neil, you actually can get a pretty good freeze with finely powdered dry ice. Just cover and let freeze for 3-5 minutes.  I would recommend, however, immersing the whole brain in isopentane that has been chilled (~30 minutes) in dry ice.  Just leave the brain in isopentane for 30 seconds, otherwise it can distort and fracture.  You will then need to let the (very cold, -80 degrees) brain equilibrate (warm up) to your cryostat or microtome temperature in order for it to cut smoothly.
    Good luck!
    Miles

    Miles G. Cunningham, MD PhD
    Director, Laboratory for Neural Reconstruction
    Administrative Director, McLean Fellowship in
    Neuropsychiatry and Behavioral Neurology
    Chair, ANPA Programs Committee
    Executive Director, Asniya, Inc.
    MRC 333, McLean Hospital
    Harvard Medical School
    115 Mill Street
    Belmont, MA  0²478
    office:     617.855.²051
    fax:         617.855.3199
    page:      617.855.²000

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 24, 2008 - 5:18 PM
  3. Thanks for this very helpful video. I'm interested in knowing where you purchased the freezing rod and ring that is used to form the sample mold. Alternatively what metal is the rod made of and is there any significance to the length of the freezing rod used?

    Reply
    Posted by: Ellen Y.
    April 23, 2010 - 3:57 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats