Tunna Sektionering av Slice Förberedelser för Immunohistokemi

Published 4/28/2007
3 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Denna metod gör det möjligt reproducerbara kryostat sektionering av små, svåra att hantera, vävnad bitar, t ex biopsier och skivor hjärnan. Vi använder ett enkelt steg aluminium frysning för att underlätta hanteringen av vävnad och en standard kryostat att rutinmässigt producera 5-10 micron seriella delar från 400 mikron tjocka hjärnan skivor.

Cite this Article

Copy Citation

Park, J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (3), e194, doi:10.3791/194 (2007).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Många undersökningar inom neurovetenskap, liksom andra discipliner, involvera studera små, men ändå makroskopiska bitar eller delar av vävnad som har bevarats, nyligen bort, eller exciderad men höll livskraftiga som i bit beredningar av hjärnvävnad. Efterföljande mikroskopiska studier av detta material kan vara en utmaning, eftersom vävnadsprover kan vara svårt att hantera. Visade här är en metod för att få tunna kryostatsnitt av vävnad med en tjocklek som kan variera från 0,2 till 5,0 mm. Vi skär rutinmässigt 400 mikron tjocka skivor Vibratome hjärnan seriellt till 5-10 mikron coronal kryostatsnitt. De skivor som vanligtvis först används för elektrofysiologi experiment och sedan kräver mikroskopisk analys av cytoarchitecture i regionen där inspelningarna observerades. Vi har konstruerat en enkel anordning som möjliggör kontrollerade och reproducerbara förberedelse och placering av vävnad skiva. Denna enhet består av en cylinder 5 cm i längd med en diameter på 1,2 cm, vilket fungerar som en frysning steg för segmentet. En ring glider tätt över cylindern ger väggarna runt segmentet gör att vävnaden att vara nedsänkt i frysning förening (t.ex. oktober). Detta är sedan snabbt fryses med krossad torris och den resulterande rån kan vara läge lätt för kryostat snittning. Tunna sektioner kan tina-monteras på bestruket diabilder att tillåta ytterligare studier som skall utföras, såsom olika färgning metoder, in situ hybridisering, eller immunohistokemi, vilket visas här.

Protocol

  1. Förbered mögel från tejp för oktober plattform.
  2. Fyll formen med oktober Frysning inom kryostat eller genom att använda krossad torris.
  3. Ta bort tejpen runt frysta oktober plattform.
  4. Passa märken på frysning chuck och kryostat montering scen och lås i Chuck.
  5. Sektion genom oktober plattformen tills ytan är platt.
  6. Ta bort återuppstod oktober plattform och plats på kryostat frysning scenen.
  7. Placera vävnadsprov (tidigare frysförvarade med 30% glycerol eller sackaros i PBS) i oktober
  8. Förbered frysning kolumn med ytterring utskjutande ca 5 mm ovanför toppen av kolonnen bildar bra för oktober
  9. Sätt försiktigt vävnadsprov på mitten av frysning kolumn ytan och långsamt lägga oktober tills väl är fylld.
  10. Surround frysning kolumn med krossad torris. Vävnad och oktober bör helt frysning inom 20-60 sekunder.
  11. Som förberedelse ökar i temperatur kan den yttre ringen tas bort medan provet är fryst.
  12. Skjut urval av frysning kolumn åt sidan och placera i kryostat.
  13. Placera droppe oktober på ytan av oktober plattform och ställning prov (vävnad ned) tillämpar fast tryck. Exemplar kommer snabbt frysa på oktober plattform.
  14. Säkra chuck på kryostat montering scenen med justerade märken.
  15. Sektion genom oktober ytliga till vävnadsprov.
  16. Tina montera tunna sektioner på glasskivor och lagra frysta eller i rumstemperatur.
  17. Immunreaktioner kan utföras för vävnad monterad på glas diabilder.
  18. Reagens sammanställda på bild kan vara lätt upprörd, och kan omfattas om ljuskänsliga.
  19. Senare skeden av reaktionen är enkelt genom att vända glida in avfall kärl, fuktspridande bilden, och sedan tillämpa nästa reagens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet presenteras här ger forskare med en kortfattad och lätt att följa konturerna av hur man kan få tunna kryostatsnitt av små, svåra att hantera, vävnad bitar, t ex biopsier och skivor hjärnan för vidare studier som ska utföras, t.ex. olika färgning metoder, in situ hybridisering, eller immunohistokemi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
O. C. T. Ted Pella, Inc. 27050
Glycerol Solution 30% Glycerol Solution in PBS w/v
Sucrose Solution 30% Sucrose Solution in PBS w/v

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scoutern, C. W., O'Connor, R., Cunningham, M. Perfusion fixation of research animals. Microsc. Today. 14, 26-33 (2006).
  2. Cunningham, M. G., Connor, C. M., Zhang, K., Benes, F. M. Diminished serotonergic innervation of adult medial prefrontal cortex after 6-OHDA lesions in the newborn rat. Brain Res. Dev. Brain Res. 157, 124-131 (2005).

Comments

3 Comments

  1. Thank-you for posting this video. Your device seems to work well with small tissue, but what do you use for freezing whole adult rat brains? Is the powdered dry ice method sufficient alone to reduce freezing artifact if you are freezing a whole adult brain? Do you have an alternative procedure for these applications?   Much appreciated,
    Neil

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 23, 2008 - 4:04 AM
  2. Hi Neil, you actually can get a pretty good freeze with finely powdered dry ice. Just cover and let freeze for 3-5 minutes.  I would recommend, however, immersing the whole brain in isopentane that has been chilled (~30 minutes) in dry ice.  Just leave the brain in isopentane for 30 seconds, otherwise it can distort and fracture.  You will then need to let the (very cold, -80 degrees) brain equilibrate (warm up) to your cryostat or microtome temperature in order for it to cut smoothly.
    Good luck!
    Miles

    Miles G. Cunningham, MD PhD
    Director, Laboratory for Neural Reconstruction
    Administrative Director, McLean Fellowship in
    Neuropsychiatry and Behavioral Neurology
    Chair, ANPA Programs Committee
    Executive Director, Asniya, Inc.
    MRC 333, McLean Hospital
    Harvard Medical School
    115 Mill Street
    Belmont, MA  0²478
    office:     617.855.²051
    fax:         617.855.3199
    page:      617.855.²000

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 24, 2008 - 5:18 PM
  3. Thanks for this very helpful video. I'm interested in knowing where you purchased the freezing rod and ring that is used to form the sample mold. Alternatively what metal is the rod made of and is there any significance to the length of the freezing rod used?

    Reply
    Posted by: Ellen Y.
    April 23, 2010 - 3:57 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats