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人多能干细胞的免疫组织化学分析,使用自制Cytospin器械

Biology

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Summary

暂停人类多能干细胞的细胞表面标记的免疫细胞化学染色(hPSCs)(SSEA-3/SSEA-4)是实现的基础上使用自制的c​​ytospin设备创建一个观察和定量细胞单层。

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Pascual, E. Y., Riggs, M. J., Rao, R. R. Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus. J. Vis. Exp. (38), e1944, doi:10.3791/1944 (2010).

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Abstract

人类多能干细胞(hPSCs),包括人类胚胎干细胞(胚胎干细胞)和人类诱导多能干细胞(人iPS细胞)是令人兴奋的细胞来源,由于其无限的自我更新能力和分化成多种细胞类型的潜力。 hPSCs多能状态是典型的评估,如定量PCR,免疫细胞化学技术,以及其他

Protocol

第1部分:暂停免疫细胞化学染色

  1. 株的细胞成单细胞悬液。
  2. 细胞,然后转移到1.5 - 2ML离心管,离心4分钟,在200克。
  3. 细胞被吸出上清液洗涤,重悬的PBS液1ml - (无镁2 +和Ca 2 +),然后离心200克再次为4分钟。这应该是做了两次。
  4. 洗涤后,细胞,然后重新暂停固定毫升4%多聚甲醛在室温(PFA)10分钟。
  5. 细胞的PBS液1ml两次冲洗一遍 - 。
  6. 洗涤后,阻止细胞重新暂停座解决方案的1ML(6%serum/94%的PBS - )。在室温下孵育45分钟。
  7. 后,在200克离心管4分钟和吸座解决方案。重新挂起的主要抗体溶液(座推荐的稀释溶液)1ML的细胞。细胞可以在室温下孵育1小时或4 ° C过夜,然后再继续下一步。
  8. 细胞,然后洗两次1ML座解决方案。
  9. 之后,重新悬浮细胞在二次抗体溶液座推荐的稀释溶液,在室温下孵育1小时1ML。
  10. 1小时后,细胞被冲洗一遍,然后与座解决方案1ML的两倍。
  11. 洗涤座解决方案后,用PBS液1ml细胞再次 - 。
  12. 各种清洗液后,再暂停为1ml细胞的DAPI核染色(1:10,000稀释在PBS的DAPI - ),并在室温下孵育5分钟。
  13. 5分钟后,在200克离心管4分钟。吸出DAPI核染色的PBS液1ml溶液中,并重新挂起细胞 - 。

第2部分:通过cytospin仪器产生的幻灯片将在hPSCs

  1. 准备他们所需数量的孔,与一台钻床的塑料滑梯。直径需要在最1毫米比要使用最广泛的微量提示(S)的直径较大。
  2. 滤纸切用剪刀塑料幻灯片的参数。
  3. 孔,然后在滤纸上。孔的尺寸(S)应足够大,适合snuggly通过它微量提示(S)。
  4. 后,准备的塑料滑梯之一是放置在顶部切滤纸(图1)的底部放置玻片。该层是固定用胶带。
  5. 一个100μL最大,从第1部分染色的细胞悬液(取决于所需的单层密度),然后放入微量提示(S)的顶部。
  6. 如果有必要,可以权衡与细胞溶液的器具,并创建一个类似重量的此消彼长。
  7. cytospin仪器和制衡,然后放置在台式离心机200克离心4分钟。
  8. 离心后,cytospin仪器仔细拆解的方式,不打跑从载玻片上的细胞。
  9. 如果有必要,多余的周围PBS - 玻璃上侧吸气。
  10. 细胞可以被视为使用荧光显微镜检查所需的细胞单层,已经取得了。

第3部分:安装滑轨

  1. 一个所需的安装媒体的下降是直接放置在每个含有细胞的区域中心。
  2. 后,盖玻片,轻轻地降低到幻灯片的尝试,以避免气泡,如果可能的话。
  3. 然后从幻灯片中删除多余的安装媒体。
  4. 之后,双方盖玻片密封指甲油。
  5. 幻灯片可以保持在一个黑暗的存储区域,直到观察和记录结果。

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Discussion

对于我们实验室的目的,对小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)的干细胞成长的文化35毫米菜配发的免疫细胞化学染色程序与使用的cytospin仪器。酶传代细胞,然后收集,消除尽可能MEF层之多,成单细胞悬液。如果需要更有效地从MEF层干细胞的分离,菌落可手动挑选然后悬挂消化。如果馈线自由的条件下使用,在越来越多的干细胞培养的菌落可以简单地被刮掉,并悬挂消化。虽然最初的单细胞悬液,是理想的,任何细胞团块要切实破裂各地众多的洗涤和免疫细胞化学染色过程中的再悬浮步骤。

视频集中使用的染色hPSCs外标记。如果需要的话,细胞内染色的hPSCs座解决方案除了前(步骤1.6)需要额外的步骤要做,其中的细胞通透性解决方案1ML洗(50mLs高盐缓冲液25μL吐温20)的三倍之前重新暂停座解决方案。应该提到的另一个关键点是,从1.9过程中的步骤,应在减少光线照射到的样本,以防止二次抗体荧光漂白的DAPI核染色。

由于众多的洗涤和再悬浮过程中的步骤,整个通道准备的估计,大约有400K - 600K细胞的干细胞的殖民地,一个良好的金额35毫米盘,建议被消化,在最初的悬挂和使用。这是由于程序的性质,一些细胞丧失的预期。从理论上讲,细胞量要小得多,可以在最初的悬浮液,但使用量,以进一步减少细胞的损失,必须采取额外的照顾。当加载到cytospin仪器后,免疫细胞化学染色程序,一个10K - 50K的细胞密度的理想选择。应该提到,虽然100μL是可以加载到cytopsin器具,使用0.1μL的10μL微量提示的最高金额,金额较小的(约20μL - 30μL),其中包含理想的细胞密度建议。这可以最大限度地减少不必要的载玻片上,溢出的液体。最后,一​​起使用时,离心机cytospin仪器,只要仪器是从横向运动,离心机的运行时,我们的知识创建的力量,足以保持翻转或脱落的装置,安全。

成分在免疫过程中使用的解决方案:

  1. 2%多聚甲醛(PFA)/ 2%的蔗糖
    1. 添加加热搅拌板56 75毫升蒸馏水,并将其放置° C。
    2. 称取2克煤灰,并添加到玻璃烧杯。
    3. 称取2 g蔗糖,并添加煤灰在玻璃烧杯。
    4. 加入2滴1M氢氧化钠。
    5. 一旦所有的试剂了解决方案,添加10毫升的10倍PBS +。
    6. 调整pH值7.2-7.4解决方案。
    7. 容至100 ml,用蒸馏水。
      储存于4 ° C和1个星期内使用。等分可以存放1个月@ -20 ° C。短暂离心解冻后,以消除任何沉淀。
  2. 座解决方案(10毫升)
    1. 加入9.4毫升PBS - 。
    2. 添加0.6毫升血清的PBS - 。 (这可能需要为每个抗体的优化。)
      储存于4 ° C,并在48小时内使用。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

为这项工作提供部分资金由美国国家科学基金会CAREER 0744556(RAO),通过在VCU的霍华德休斯医学研究所的科学教育和研究发展计划(帕斯夸尔)的奖学金。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lab Tek Permanox Chamber Slide Thermo Fisher Scientific, Inc. 117437 Material for re-used plastic slides
Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned Fisher Scientific 12-550-15
0.1-10μL Filter Tips USA Scientific, Inc. 1121-3810
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 120542-B
Cytoseal 280 Richard-Allan Scientific 8311-4 Mounting Medium
DPBS GIBCO, by Life Technologies 14190
Normal Goat Serum Invitrogen 10000C
Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody EMD Millipore MAB4304 Primary Antibody for SSEA-4 staining
Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody EMD Millipore MAB4303 Primary Antibody for SSEA-3 staining
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG Invitrogen A11029 Secondary Antibody for SSEA-4 staining
Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG Invitrogen A11006 Secondary Antibody for SSEA-3 staining
DAPI, Dihydrochloride Calbiochem 268298

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. Cell surface markers in human embryonic stem cells. Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).
  2. Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. A homemade cytospin apparatus. Anal. Biochem. 359, 283-284 (2006).

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