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Immunzytochemische Analyse von menschlichen pluripotenten Stammzellen mit Hilfe eines Self-Made Cytospin Apparatus

Biology

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Summary

Suspension immunzytochemische Färbung von menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) für Zell-Oberflächen-Marker (SSEA-3/SSEA-4) wurde basierend auf der Verwendung einer self-made Zytospin Apparat zu einer Monoschicht von Zellen für die Beobachtung und Quantifizierung erstellen erreicht.

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Pascual, E. Y., Riggs, M. J., Rao, R. R. Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus. J. Vis. Exp. (38), e1944, doi:10.3791/1944 (2010).

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Abstract

Menschliche pluripotente Stammzellen (hPSCs), dass menschliche embryonale Stammzellen (hES) und der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) enthalten, werden spannende Zellquellen aufgrund ihrer grenzenlosen Selbst-Erneuerung Fähigkeiten und ihr Potenzial, in verschiedenen Zelltypen zu differenzieren. Die pluripotenten Zustand hPSCs ist in der Regel durch Techniken wie qPCR, Immunzytochemie beurteilt und von anderen

Protocol

Teil 1: Die Aussetzung immunzytochemische Färbung

  1. Die Zellen werden in einer einzigen Zellsuspension geerntet.
  2. Die Zellen werden dann in 1,5-2ml Reaktionsgefäße überführt und zentrifugiert bei 200g für 4 Minuten.
  3. Die Zellen werden durch Absaugen aus Überstand gewaschen, in 1 ml PBS resuspendiert - (ohne Mg 2 + und Ca 2 +) und dann wieder bei 200g für 4 Minuten zentrifugiert. Dies sollte zweimal durchgeführt werden.
  4. Nach dem Waschen werden die Zellen dann durch Resuspendieren sie in 1 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) bei Raumtemperatur für 10 Minuten fixiert.
  5. Die Zellen werden erneut zweimal mit 1 ml PBS gewaschen -.
  6. Nach dem Waschen, Block-Zellen durch Resuspendieren sie in 1-ml-Block-Lösung (6% serum/94% PBS -). Inkubieren diese bei Raumtemperatur für 45 Minuten.
  7. Nach, Zentrifugenröhrchen bei 200g für 4 Minuten und saugen aus Block-Lösung. Re-suspend-Zellen in 1 ml des primären Antikörper-Lösung (hergestellt mit Block-Lösung in der empfohlenen Verdünnung). Die Zellen können entweder bei Raumtemperatur für 1 Stunde oder bei 4 ° C über Nacht, bevor Sie den nächsten Schritt inkubiert werden.
  8. Die Zellen werden dann zweimal mit 1 ml Block-Lösung gewaschen.
  9. Nach, resuspendieren Zellen in 1 ml des sekundären Antikörper-Lösung (hergestellt mit Block-Lösung in der empfohlenen Verdünnung) und Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
  10. Nach 1 Stunde, sollten die Zellen dann wieder zweimal mit 1 ml Block-Lösung gewaschen.
  11. Nach dem Waschen mit Block-Lösung, waschen Sie die Zellen wieder mit 1ml PBS -.
  12. Nach den verschiedenen Waschungen wieder auszusetzen Zellen in 1ml von DAPI Kernfärbung (1:10000 Verdünnung von DAPI in PBS -) und Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
  13. Nach 5 Minuten Zentrifugenröhrchen bei 200g für 4 Minuten. Saugen Sie die DAPI Kernfärbung Lösung und resuspendieren Zellen in 1 ml PBS -.

Teil 2: Der Einbau von hPSCs in gleitet durch Zytospin Vorrichtung erzeugt

  1. Kunststoff Folien sind, indem sie die gewünschte Menge Löcher in ihnen mit einer Bohrmaschine vorbereitet. Der Durchmesser muss in den meisten 1mm größer als der größte Durchmesser der Mikropipette Spitze (n) verwendet werden.
  2. Filterpapier ist es, die Parameter der Kunststoff-Objektträger mit der Schere geschnitten.
  3. Die Löcher werden dann in den Filter-Papier. Die Größe der Bohrung (en) sollte groß genug sein, dass die Mikropipette Spitze (n) snuggly passt durch.
  4. Nach einer der vorbereiteten Folien aus Kunststoff ist auf der Oberseite und einem Glasträger in an der Unterseite des Schnittes Filterpapier (Abbildung 1) platziert. Die Schichten sind mit Klebeband befestigt.
  5. Es können maximal 100 &mgr; (abhängig von der gewünschten Monoschicht Dichte) der angefärbten Zellsuspension aus Teil 1 wird dann in der Spitze der Mikropipette Spitze (n) platziert.
  6. Falls erforderlich, kann das Gerät mit Zell-Lösung gewogen und ein Gegengewicht von ähnlichem Gewicht geschaffen.
  7. Die Zytospin Apparate und Gegengewicht können, sind dann in einem Desktop-Zentrifuge gegeben und zentrifugiert bei 200g für 4 Minuten.
  8. Nach dem Zentrifugieren wird die Zytospin Apparat sorgfältig in einer Weise, verdrängen die Zellen aus dem Glasträger doesnt demontiert.
  9. Wenn nötig, überschüssige umliegenden PBS - auf Glasseite in abgesaugte.
  10. Die Zellen können dann eine Anzeige mit einem Fluoreszenz-Mikroskop zu überprüfen, ob die gewünschte Zellmonolayer erreicht worden ist.

Teil 3: Anschluss Dias

  1. Ein Tropfen der gewünschten Montage Medien direkt in der Mitte jeder Bereich mit mehreren Zellen gelegt.
  2. Nach, ist ein Deckglas vorsichtig auf die Dias versucht, um Luftblasen zu vermeiden, wenn möglich, gesenkt werden.
  3. Überschüssiges Eindeckmittel wird dann von Dias entfernt.
  4. Nach, sind die Seiten der Deckgläser mit Nagellack versiegelt.
  5. Die Folien können in einem dunklen Lagerraum aufbewahrt werden, bis Ergebnisse beobachtet und dokumentiert werden.

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Discussion

Für die Zwecke unseres Labors, ist ein 35-mm-Schale von Stammzell-Kulturen auf embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) gewachsen für die immunzytochemische Färbung Verfahren für den Einsatz mit dem Zytospin Apparat zugeteilt. Die Zellen werden dann mit Hilfe von enzymatischen Passagieren gesammelt, die Beseitigung so viel von der MEF-Schicht wie möglich, in einen Ein-Zell-Suspension. Wenn effektiver Stammzellen isoliert von der MEF-Schicht gewünscht wird, kann Kolonien manuell kommissioniert dann verdaut in Suspension. Wenn Anleger freien Bedingungen in das Wachstum der Stammzellen Kulturen verwendet werden, können die Kolonien einfach abgeschabt werden und verdaut in Suspension. Während einer ersten Single-Zell-Suspension ist ideal, sollte jede zelluläre Klumpen effektiv auseinander ganzen zahlreichen Wasch-und Resuspension Schritte für die immunzytochemische Färbung Prozedur aufgerufen gebrochen werden.

Das Video konzentrierte sich auf den Einsatz von extrazellulären Marker für die Färbung hPSCs. Wenn intrazelluläre Färbung der hPSCs gewünscht ist, muss ein zusätzlicher Schritt vor der Zugabe von Block-Lösung (Schritt 1,6) zu tun, wobei die Zellen in 1 ml der Permeabilisierung Lösung gewaschen werden (50mLs der hohen Salz-Puffer mit 25 &mgr; l von Tween 20) dreimal vor Resuspendieren sie in Block-Lösung. Ein weiterer kritischer Punkt, der erwähnt werden sollte ist, dass aus Schritt 1.9 in das Verfahren, Pflege bei der Minimierung von Belichtung, um die Proben zur Fluoreszenz Ausbleichen der sekundären Antikörper und DAPI Kernfärbung zu verhindern getroffen werden sollten.

Aufgrund der zahlreichen Wasch-und Resuspension Schritte des Verfahrens, eine ganze 35mm Teller mit einer guten Portion der Passage-ready Stammzellen Kolonien auf rund 400k-600k-Zellen haben, wird empfohlen, um verdaut zu werden und in den ersten Suspension verwendet . Dies ist in Erwartung einiger Zellverlust durch die Art des Verfahrens gemacht. Theoretisch kann eine viel kleinere Menge an Zellen in der ersten Suspension eingesetzt werden, sondern einen zusätzlichen Betrag von darauf zu achten, um weiter zu minimieren Zellverlust sein. Beim Laden auf den Zytospin Apparat nach der immunzytochemische Färbung ist eine Zelldichte von 10k-50k ideal. Es sollte erwähnt werden, dass zwar 100 &mgr; ist die maximale Menge, die auf eine cytopsin Gerät, dass eine 0.1μL 10 &mgr; l-Mikropipette Spitze verwendet geladen werden kann, eine kleinere Menge (ca. 20 &mgr; l - 30μL) werden mit den idealen Zelldichte wird empfohlen. Dies minimiert unnötige Überlauf der Flüssigkeit auf den Objektträger. Schließlich, wenn Sie die Zytospin Apparat mit der Zentrifuge, solange das Gerät ist sicher von der seitlichen Bewegung, die Kraft der Zentrifuge erzeugt beim Laufen hat, ist unseres Wissens ausreichend im Sinne der Apparat von Spiegeln oder fallen aus.

Zutaten für Lösungen in der immunzytochemische Verfahren verwendet:

  1. 2% Paraformaldehyd (PFA) / 2% Saccharose
    1. 75 ml destilliertem Wasser, und am beheizten Rührplatte bei 56 ° C.
    2. Abwiegen 2 g PFA, und fügen Sie Becherglas.
    3. Abwiegen 2 g Saccharose, und fügen Sie PFA in Becherglas.
    4. 2 Tropfen 1M Natronlauge.
    5. Nachdem alle Reagenzien in Lösung gegangen sind, 10 ml 10x PBS + +.
    6. Den pH-Wert der Lösung auf 7,2-7,4.
    7. Bringen Sie up-Volumen auf 100 ml mit destilliertem Wasser.
      Lagerung bei 4 ° C und innerhalb von 1 Woche zu verwenden. Aliquots gelagert bei -20 ° C für 1 Monat. Zentrifuge kurz nach dem Auftauen auf keinen Niederschlag zu entfernen.
  2. Block-Lösung (10 mL)
    1. Fügen Sie 9,4 ml PBS -.
    2. Fügen Sie 0,6 ml Serum der PBS -. (Eventuell müssen Sie diese für jeden Antikörper optimiert werden.)
      Lagerung bei 4 ° C und innerhalb von 48 Stunden verwenden.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Teilfinanzierung für diese Arbeit wurde von der NSF-CAREER 0744556 (Rao) und ein Stipendium durch die VCU-HHMI Science Education und Research Program (Pascual) zur Verfügung gestellt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lab Tek Permanox Chamber Slide Thermo Fisher Scientific, Inc. 117437 Material for re-used plastic slides
Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned Fisher Scientific 12-550-15
0.1-10μL Filter Tips USA Scientific, Inc. 1121-3810
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 120542-B
Cytoseal 280 Richard-Allan Scientific 8311-4 Mounting Medium
DPBS GIBCO, by Life Technologies 14190
Normal Goat Serum Invitrogen 10000C
Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody EMD Millipore MAB4304 Primary Antibody for SSEA-4 staining
Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody EMD Millipore MAB4303 Primary Antibody for SSEA-3 staining
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG Invitrogen A11029 Secondary Antibody for SSEA-4 staining
Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG Invitrogen A11006 Secondary Antibody for SSEA-3 staining
DAPI, Dihydrochloride Calbiochem 268298

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. Cell surface markers in human embryonic stem cells. Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).
  2. Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. A homemade cytospin apparatus. Anal. Biochem. 359, 283-284 (2006).

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