חילוץ ה-DNA של חיידקים במעיים של טרמיטים (Zootermopsis Angusticollis) באופן חזותי חיידקים גוט

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

וידאו זה מדגים את הטכניקה להפקת DNA של זנים של חיידקים במעי האחורי תושב טרמיטים. ההכנה של שקופית הר רטוב, אשר הוא שימושי עבור לדמיין את הקהילה חיידקים במעיים מודגם גם, סיור דרך הסביבה, מינים עשיר הבטן הוא נתון.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Matson, E., Ottesen, E., Leadbetter, J. Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes. J. Vis. Exp. (4), e195, doi:10.3791/195 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

הטרמיטים הם בין החיות כמה שידוע יש את היכולת להתקיים אך ורק על ידי עץ רב. בדרכי המעיים טרמיטים מכיל אוכלוסייה צפופה של חיידקים מינים עשיר המסייע השפלה של lignocellulose בעיקר לתוך אצטט, מרכיב מפתח תדלוק מטבוליזם טרמיטים (Odelson & Breznak, 1983). בתוך אלה אוכלוסיות חיידקים הם חיידקים קדומים methanogenic, ובחלק ("נמוך") טרמיטים, אוקריוטים פרוטוזואה. לפיכך, טרמיטים הם נושאי מחקר מעולה לחקר יחסי הגומלין בין מינים של חיידקים ושל פונקציות ביוכימיים רבים שהם מבצעים לטובת המארחות. הרכב זנים של אוכלוסיות חיידקים במעיים טרמיטים וכן הגנים המרכזיים המעורבים בתהליכים ביוכימיים שונים נחקר תוך שימוש בטכניקות מולקולריות (Kudo et al, 1998;. Schmit-וגנר et al, 2003;. Salmassi & לידבטר, 2003). טכניקות אלו תלויים החילוץ וטיהור איכותיים חומצות גרעין מהסביבה בטן טרמיטים. טכניקת מיצוי המתואר וידאו זה הוא אוסף שונה של פרוטוקולים שפותחו להפקת וטיהור של חומצות גרעין מ דגימות סביבתיות (מור et al, 1994;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi & לידבטר, 2003;. Ottesen et al 2006), הוא מייצר DNA מן החומר במעי האחורי טרמיטים מתאים לשימוש כתבנית לתגובת שרשרת פולימרז (PCR).

Protocol

סיכום פרוצדורלי להפקת שלם במעי טרמיטים DNA:

  1. טרמיטים צ'יל על הקרח, להסיר במעיים באמצעות פינצטה סטרילי ולייצב דגימות המעיים במאגר.
  2. Homogenize דגימות PVPP / SDS / חיץ פנול.
  3. תמצית ולטהר דנ"א lysate גולמי באמצעות Qiagen עמודות DNeasy.

פרוטוקול:

  1. על קרח, להסיר את האומץ של כת טרמיטים עובד באמצעות מלקחיים סטרילית.
  2. מיד להעביר את אומץ התכנים צינור סטרילי nuclease חינם, המכיל 50 μL קר כקרח 1x ביולוגיה מולקולרית כיתה TE חיץ (1 mM טריס-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0). להקפיא דגימות -20 ° C, או להמשיך ישירות עם homogenization.
  3. העברת דגימות המעי חיץ צינור סטרילי, nuclease ללא מ"ל 2 בורג כתרים טעון מראש עם 500 מ"ג של zirconia / סיליקה חרוזים סטרילית (0.1 מ"מ) ו - 700 μl של חיץ TE 1x המכיל 1% w / v polyvinylpolypyrrolidone (PVPP ).
  4. הוסף 50 μl של סולפט 20% נתרן dodecyl (SDS) ו - 500 μl של פנול על דגימות.
  5. Homogenize (פעימה חרוז) על הגדרת הגבוהה ביותר באמצעות שלושה מחזורים של 30 שניות homogenization ו 30 שניות של מצמרר על הקרח.
  6. משקעים חומר מסיס 1 דקות ב 8000 x גרם.
  7. לטהר 300 μl aliquots של השכבה (העליון) מימית עם עמודות Qiagen DNeasy בשיטה המתוארת לטיהור lysate גולמי.
  8. לכמת תוכן חומצות גרעין דגימות להקפיא ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מניסיוננו, DNA המופק הקהילות מיקרוביאלי של עץ האכלה מינים טרמיטים כמו nevadensis Zootermopis טהור מספיק עבור תבנית PCR לאחר סבב אחד של מיצוי וטיהור. עם זאת, כמה טרמיטים כגון האכלה, המלטה ואדמה האכלה המינים יכולה להיות ריכוז גבוה של חומצות humic של תוכן המעיים שלהם והן עשויות לחייב טיהור נוסף של ה-DNA של חיידקים במעיים. התשואה DNA הכולל את הקרביים של 5 עובדים צ'nevadensis הוא בטווח של 10-30 מיקרוגרם. עבור מינים טרמיטים משמעותית קטן או גדול יותר ממין זה, דגימות יותר או פחות עשוי להיות נחוץ כדי להשיג סכום דומה של ה-DNA.

שיטה זו יכולה בקלות להיות מותאם כדי לאפשר מיצוי RNA. להפקת RNA, תחליף 1x חיידקים מגיב RNAprotect מ Qiagen (קטלוג מוצרים לא. 76,506) עבור למאגר TE קר כקרח המתואר בשלב 2 של הפרוטוקול. Qiagen ריאגנטים RNeasy ועמודות (קטלוג מוצרים לא. 74,104) יש להשתמש במקום הליך הטיהור DNeasy שתוארו לעיל. כמו DNA יכול להיות מטוהרים מן RNAprotect מיוצב דגימות רק 300 μL של כ. 700 שכבה מימית μL לאחזר בשלב 7 נדרשת עבור טיהור חומצות גרעין, בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לאחזר הן DNA ו-RNA במקביל ממדגם אחד.

טכניקות אלו תלויים החילוץ וטיהור איכותיים חומצות גרעין מהסביבה בטן טרמיטים. טכניקת מיצוי המתואר וידאו זה הוא אוסף שונה של פרוטוקולים שפותחו להפקת וטיהור של חומצות גרעין מ דגימות סביבתיות (יותר et al, 1994;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi & לידבטר, 2003;. Ottesen et al 2006), הוא מייצר DNA מן החומר במעי האחורי טרמיטים מתאים לשימוש כתבנית לתגובת שרשרת פולימרז (PCR).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PVPP/SDS/phenol Buffer homogeneization buffer
DNeasy Tissue Kit Kit Qiagen 77607 Used according to the protocol for isolation of genomic DNA from crude lysates (Appendix H, product manual version: July 2003)
TE Buffer Sigma-Aldrich T9285 1x buffer (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) from 100x concentrate
zirconia/silica beads Supplies Biospec Products 11079101z 0.1 mm
PVPP Reagent Sigma-Aldrich P6755 1% w/v polyvinylpolypyrrolidone prepared from dry reagent as a 1x suspension in TE buffer
Zootermopsis nevadensis Animal Termites
SDS Reagent Sigma-Aldrich L4390 Sodium dodecyl sulfate 20% soln. in water from dry reagent
Phenol Reagent Sigma-Aldrich 77607 TE-saturated, ~73%
MiniBeadbeater-8 Tool Biospec Products 963
BSS Buffered Salt Solution, pH 7.2 Formulation per liter: 2.5 g K2HPO4, 1.0 g KH2PO4, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl, and 10 mL of a 1M soln. of NaHCO3
AxioPlan-2 Microscope Carl Zeiss, Inc. Outfitted with 40x objective, 1.6x optivar and 10x ocular lenses. Samples were viewed using phase contrast illumination

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns. FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).
  2. Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation. Extremophiles. 2, 155-161 (1998).
  3. Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).
  4. Odelson, D. A., Breznak, J. A. Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites. Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).
  5. Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria. Science. 314, 1464-1467 (2006).
  6. Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method. Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).
  7. Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis. Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).
  8. Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp). Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).
  9. Tsai, Y. L., Olson, B. H. Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).

Comments

10 Comments

  1. can you tell me the resolution power of the microscope at which you have shown the video and the make of the mcroscope used.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 17, 2007 - 12:56 AM
  2. I would also like to know the magnification used to view the microbes and if any phase contrast was used with the microscope setup. Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 20, 2007 - 6:24 PM
  3. As indicated in the updated protocol, a Zeiss AxioPlan-² Imaging microscope was used to aquire the images of termite gut microorganisms using Phase contrast illumination. Our particular set up allows magnification of samples up to 1,600X. This is accomplished using a 100X oil immersion objective lens + a 1.6X optivar + a 10X ocular lens. However, the images in the video use a 40X hi-dry phase contrast objective lens + the 1.6X optivar. To make the video, the videographer replaced the eyepiece with an adapter and attached the camera to that. Because we did not use a scale bar in these videos I do not know the magnification at which the camera recorded so the final magnification will depend on that factor + the window size used to view the video. I will say that the resolution is approximately consistent with what I observe at 640X magnification.

    Reply
    Posted by: Eric M.
    January 14, 2008 - 1:37 AM
  4. hello sir sir i am a project fellow in IIIM in india i want to know manual method how to isolate total DNA from termite and beetle gut(wood borer).sir kindly if you can provide me protocol for this i will be very thankful to you as i am in very need of it. thanking you sir and waiting for your reply

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 17, 2008 - 8:18 AM
  5. Hello,sir.I am interest in the manual DNA extraction methods from organic tissue,and acquire the best concentraction of DNA, can you provide me for this protocol, thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 20, 2009 - 6:21 AM
  6. The information should appear below the video on the JOVE website, and a PDF of the protocol should be downloadable, however, I notice that the link dŒs not currently work. An alternative path to the document can be found by searching the article on PubMed (www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) and choosing the full-text article from PubMed central. I've contacted JOVE to restore the file on their website. Several strategies for purifying insect gut-community DNA exist. A crucial step in any extraction procedure is to remove PCR-inhibiting substances if present. We have found that 1% w/v polyvinylpolypyrrolidone works well on DNA derived from termite gut contents.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 5, 2009 - 3:14 AM
  7. good job! very cool!

    Reply
    Posted by: jacqui s.
    December 12, 2009 - 7:28 AM
  8. Hi! I'm korean student. I want to see this full video.then what can i do?

    Reply
    Posted by: Hyun Y.
    October 31, 2014 - 9:47 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics