استخراج الحمض النووي من الميكروبات غوت من النمل الأبيض (Zootermopsis Angusticollis) وتصور الميكروبات غوت

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هذا الفيديو يوضح تقنية لاستخراج الحمض النووي من أنواع الميكروبات المقيمين في المعى المؤخر النمل الأبيض. ويتضح ايضا في اعداد شريحة جبل الرطب ، وهو أمر مفيد لتصور المجتمع الميكروبية الأمعاء ، ويعطى من خلال جولة الأنواع الغنية بيئة الأمعاء.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Matson, E., Ottesen, E., Leadbetter, J. Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes. J. Vis. Exp. (4), e195, doi:10.3791/195 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

النمل الأبيض هي من بين عدد قليل من الحيوانات المعروفة لديهم القدرة على العيش فقط من الخشب طويلا. الجهاز يحتوي على أمعاء النمل الأبيض كثيفة السكان الميكروبية والأنواع الغنية التي تساعد في تدهور lignocellulose في الغالب إلى خلات والمغذيات الرئيسية تأجيج الأيض النمل الأبيض (Odelson وBreznak ، 1983). ضمن هؤلاء السكان هي البكتيريا الجرثومية ، وميثان العتيقة ، في بعض النمل الأبيض ("خفض") ، البروتوزوا حقيقية النواة. وهكذا ، النمل الأبيض وتخضع البحوث الممتازة لدراسة التفاعلات بين الأنواع الجرثومية والكيميائية الحيوية وظائف عديدة أنها تؤدي إلى منفعة المضيفة لهم. وقد تم اكتشاف تركيبة السكان الأنواع الميكروبية في أمعاء النمل الأبيض وكذلك الجينات الرئيسية المشاركة في العمليات الحيوية المختلفة وذلك باستخدام التقنيات الجزيئية (كودو وآخرون ، 1998 ؛. شميت ، واجنر وآخرون ، 2003 ؛. Salmassi ويدبيتر ، 2003). هذه التقنيات تعتمد على استخراج وتنقية عالية الجودة الأحماض النووية من البيئة أمعاء النمل الأبيض. تقنية استخراج وصفها في هذا الفيديو هو عبارة عن تجميع معدلة من البروتوكولات التي وضعت لاستخراج وتنقية الأحماض النووية من العينات البيئية (مور وآخرون ، 1994 ؛. Berthelet وآخرون ، 1996 ؛. بوردي وآخرون ، 1996 ؛. Salmassi ويدبيتر ، 2003 ؛ Ottesen وآخرون 2006) ، وأنها تنتج من مادة الحمض النووي المعى المؤخر النمل الأبيض مناسبة للاستخدام كقالب لتفاعل البلمرة المتسلسل (PCR).

Protocol

ملخص الإجرائية لاستخراج الحمض النووي النمل الأبيض كامل الأمعاء :

  1. النمل الأبيض البرد على الجليد ، وإزالة الأمعاء باستخدام ملاقط معقمة والاستقرار في عينات الأمعاء العازلة.
  2. التجانس في عينات PVPP / SDS / العازلة الفينول.
  3. استخراج وتنقية الحمض النووي من الخام باستخدام lysate Qiagen DNeasy الأعمدة.

البروتوكول :

  1. على الجليد ، وإزالة الشجاعة من النمل العامل الطبقي باستخدام ملقط معقم.
  2. نقل على الفور إلى الشجاعة ومحتويات أنبوب nuclease معقمة وخالية من الجليد يحتوي على 50 ميكرولتر الباردة 1X البيولوجيا الجزيئية الصف TE العازلة (1 ملم تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، EDTA 0.1 ملم ، ودرجة الحموضة 8.0). تجميد العينات في -20 درجة مئوية ، أو الانتقال مباشرة مع التجانس.
  3. نقل العينات القناة الهضمية والعازلة لعقيمة ، nuclease خالية من 2 مل أنبوب المسمار توج محملة مسبقا مع 500 ملغ من الخرز الزركونيا / السيليكا العقيمة (0.1 ملم) و 700 ميكرولتر من TE 1X العازلة التي تحتوي على 1 ٪ ث / ت polyvinylpolypyrrolidone (PVPP ).
  4. إضافة 50 ميكرولتر 20 ٪ كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) و 500 ميكرولتر من الفينول للعينات.
  5. التجانس (فاز حبة) على أعلى الإعداد باستخدام ثلاث دورات من التجانس ثوانى 30 و 30 ثانية من تقشعر لها الأبدان على الجليد.
  6. مواد غير قابلة للذوبان الرواسب 1 دقيقة في لز س 8000.
  7. تطهير 300 ميكرولتر aliquots طبقة (العلوي) مع الأعمدة المائية Qiagen DNeasy باستخدام الطريقة الموصوفة لتنقية lysate الخام.
  8. تحديد محتوى حمض النووي وتجميد العينات في -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في تجربتنا ، الحمض النووي المستخرج من المجتمعات الميكروبية أنواع النمل الأبيض الخشب الثديية مثل nevadensis Zootermopis نقية بما فيه الكفاية لقالب PCR بعد جولة واحدة من استخراج وتنقية. ومع ذلك ، قد يكون بعض النمل الأبيض مثل التغذية وأنواع التربة القمامة الثديية لها تركيز أعلى من الأحماض الدبالية في محتويات حدسهم وتتطلب تنقية إضافية من الحمض النووي الميكروبية الأمعاء. الحمض النووي العائد الكلي من الشجاعة من 5 عمال nevadensis Z. هو في حدود 10-30 ميكروغرام. بالنسبة للأنواع النمل الأبيض أصغر بكثير أو أكبر من هذا النوع ، قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من العينات أو أقل للحصول على مبلغ مماثل من الحمض النووي.

ويمكن بسهولة أن تتكيف هذه الطريقة للسماح استخراج الحمض النووي الريبي. لاستخراج الحمض النووي الريبي ، بديلا 1X كاشف RNAprotect من البكتيريا Qiagen (catlog رقم 76506) لالعازلة TE الجليد الباردة هو موضح في الخطوة 2 من البروتوكول. وينبغي استخدام الكواشف Qiagen RNeasy والأعمدة (catlog رقم 74104) بدلا من الإجراء تنقية DNeasy المذكورة أعلاه. كما يمكن تنقيته من الحمض النووي من عينات RNAprotect استقرت وفقط 300 ميليلتر من تقريبا. مطلوب 700 طبقة مائية ميكرولتر استردادها في الخطوة 7 لتنقية حمض النووي ، ويمكن استخدام هذه الطريقة لاسترداد كل من الحمض النووي الريبي وبالتوازي من عينة واحدة.

هذه التقنيات تعتمد على استخراج وتنقية عالية الجودة الأحماض النووية من البيئة أمعاء النمل الأبيض. تقنية استخراج وصفها في هذا الفيديو هو عبارة عن تجميع معدلة من البروتوكولات التي وضعت لاستخراج وتنقية الأحماض النووية من العينات البيئية (أكثر وآخرون ، 1994 ؛. Berthelet وآخرون ، 1996 ؛. بوردي وآخرون ، 1996 ؛. Salmassi ويدبيتر ، 2003 ؛ Ottesen وآخرون 2006) ، وأنها تنتج من مادة الحمض النووي المعى المؤخر النمل الأبيض مناسبة للاستخدام كقالب لتفاعل البلمرة المتسلسل (PCR).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PVPP/SDS/phenol Buffer homogeneization buffer
DNeasy Tissue Kit Kit Qiagen 77607 Used according to the protocol for isolation of genomic DNA from crude lysates (Appendix H, product manual version: July 2003)
TE Buffer Sigma-Aldrich T9285 1x buffer (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) from 100x concentrate
zirconia/silica beads Supplies Biospec Products 11079101z 0.1 mm
PVPP Reagent Sigma-Aldrich P6755 1% w/v polyvinylpolypyrrolidone prepared from dry reagent as a 1x suspension in TE buffer
Zootermopsis nevadensis Animal Termites
SDS Reagent Sigma-Aldrich L4390 Sodium dodecyl sulfate 20% soln. in water from dry reagent
Phenol Reagent Sigma-Aldrich 77607 TE-saturated, ~73%
MiniBeadbeater-8 Tool Biospec Products 963
BSS Buffered Salt Solution, pH 7.2 Formulation per liter: 2.5 g K2HPO4, 1.0 g KH2PO4, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl, and 10 mL of a 1M soln. of NaHCO3
AxioPlan-2 Microscope Carl Zeiss, Inc. Outfitted with 40x objective, 1.6x optivar and 10x ocular lenses. Samples were viewed using phase contrast illumination

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns. FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).
  2. Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation. Extremophiles. 2, 155-161 (1998).
  3. Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).
  4. Odelson, D. A., Breznak, J. A. Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites. Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).
  5. Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria. Science. 314, 1464-1467 (2006).
  6. Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method. Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).
  7. Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis. Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).
  8. Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp). Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).
  9. Tsai, Y. L., Olson, B. H. Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).

Comments

10 Comments

  1. can you tell me the resolution power of the microscope at which you have shown the video and the make of the mcroscope used.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 17, 2007 - 12:56 AM
  2. I would also like to know the magnification used to view the microbes and if any phase contrast was used with the microscope setup. Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 20, 2007 - 6:24 PM
  3. As indicated in the updated protocol, a Zeiss AxioPlan-² Imaging microscope was used to aquire the images of termite gut microorganisms using Phase contrast illumination. Our particular set up allows magnification of samples up to 1,600X. This is accomplished using a 100X oil immersion objective lens + a 1.6X optivar + a 10X ocular lens. However, the images in the video use a 40X hi-dry phase contrast objective lens + the 1.6X optivar. To make the video, the videographer replaced the eyepiece with an adapter and attached the camera to that. Because we did not use a scale bar in these videos I do not know the magnification at which the camera recorded so the final magnification will depend on that factor + the window size used to view the video. I will say that the resolution is approximately consistent with what I observe at 640X magnification.

    Reply
    Posted by: Eric M.
    January 14, 2008 - 1:37 AM
  4. hello sir sir i am a project fellow in IIIM in india i want to know manual method how to isolate total DNA from termite and beetle gut(wood borer).sir kindly if you can provide me protocol for this i will be very thankful to you as i am in very need of it. thanking you sir and waiting for your reply

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 17, 2008 - 8:18 AM
  5. Hello,sir.I am interest in the manual DNA extraction methods from organic tissue,and acquire the best concentraction of DNA, can you provide me for this protocol, thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 20, 2009 - 6:21 AM
  6. The information should appear below the video on the JOVE website, and a PDF of the protocol should be downloadable, however, I notice that the link dŒs not currently work. An alternative path to the document can be found by searching the article on PubMed (www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) and choosing the full-text article from PubMed central. I've contacted JOVE to restore the file on their website. Several strategies for purifying insect gut-community DNA exist. A crucial step in any extraction procedure is to remove PCR-inhibiting substances if present. We have found that 1% w/v polyvinylpolypyrrolidone works well on DNA derived from termite gut contents.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 5, 2009 - 3:14 AM
  7. good job! very cool!

    Reply
    Posted by: jacqui s.
    December 12, 2009 - 7:28 AM
  8. Hi! I'm korean student. I want to see this full video.then what can i do?

    Reply
    Posted by: Hyun Y.
    October 31, 2014 - 9:47 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics