पक्षपाती और गैर पक्षपाती स्तनधारी कोशिकाओं की स्वस्थानी Subcellular Fractionation

Published 7/23/2010
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Biology

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Summary

खुर्दबीन coverslips पर स्तनधारी कोशिकाओं की स्वस्थानी subcellular fractionation में प्रोटीन स्थानीयकरण के दृश्य की अनुमति देता है.

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Sawasdichai, A., Chen, H., Abdul Hamid, N., Jayaraman, P., Gaston, K. In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (41), e1958, doi:10.3791/1958 (2010).

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Abstract

प्रोटीन समारोह परिचित प्रोटीन स्थानीयकरण के लिए युग्मित है. हालांकि कुछ प्रोटीन एक विशिष्ट स्थान या subcellular डिब्बे के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं, कई प्रोटीन एक उप जनसंख्या है कि कसकर एक विशेष subcellular डोमेन या संरचना के साथ जुड़ा हुआ है के साथ एक मुक्त विदेशी मुद्रा में स्वतंत्र रूप से diffusing जनसंख्या के रूप में मौजूद हैं. सीटू subcellular fractionation में के दृश्य की अनुमति देता है प्रोटीन compartmentalization और भी उप आबादी है कि विशिष्ट संरचनाओं के लिए स्थानीयकरण प्रोटीन प्रकट कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, घुलनशील cytoplasmic प्रोटीन और शिथिल आयोजित परमाणु प्रोटीन को हटाने chromatin के साथ कुछ प्रतिलेखन कारकों के स्थिर सहयोग प्रकट कर सकते हैं. डीएनए के बाद पाचन कुछ मामलों में प्रोटीन और RNAs कि सामूहिक रूप से परमाणु पाड़ या परमाणु मैट्रिक्स कहा जाता है के नेटवर्क के साथ सहयोग कर सकते हैं प्रकट.

यहाँ हम खुर्दबीन coverslips पर पक्षपाती और गैर पक्षपाती स्तनधारी कोशिकाओं के स्वस्थानी fractionation के दौरान आवश्यक कदम का वर्णन करता है. प्रोटीन दृश्य विशिष्ट एंटीबॉडी या फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता है है. एंटीबॉडी और / या फ्लोरोसेंट रंजक है कि विशिष्ट डिब्बों या संरचनाओं के लिए मार्कर के रूप में में कार्य प्रोटीन स्थानीयकरण विस्तार में मैप करने के लिए अनुमति देते हैं सीटू fractionation में भी पश्चिमी करने के लिए प्रत्येक अंश में मौजूद प्रोटीन की मात्रा की तुलना सोख्ता के साथ संयुक्त किया जा सकता है.. यह सरल जैव रासायनिक दृष्टिकोण संघों है कि अन्यथा नहीं चल पाता रहेगा प्रकट कर सकते हैं.

Protocol

Fractionation के लिए मैं तैयार

यह खंड पाली एल Lysine लेपित खुर्दबीन coverslips और fractionation के लिए पहले कोशिकाओं की कुर्की की तैयारी का वर्णन करता है. यदि आवश्यक कोशिकाओं प्रोटीन अभिव्यक्ति वैक्टर के साथ transiently जा सकता है या तो ट्रांसफ़ेक्ट पहले या बाद में अनुलग्नक.

पाली एल Lysine लेपित coverslips ए तैयार

  1. आसुत जल में पाली एल Lysine 1mg/ml के एक समाधान तैयार है.
  2. कोट उन्हें समाधान में 22 पर एक कमाल मंच पर कम से कम 1 घंटे के लिए incubating द्वारा पाली - एल Lysine के साथ स्वच्छ coverslips डिग्री सेल्सियस
  3. बाँझ आसुत जल के साथ लेपित coverslips दो बार धोने और 96% इथेनॉल के साथ एक एकल धोने के साथ पालन करें.
  4. एयर फिल्टर पेपर के एक टुकड़े पर लेपित coverslips सूखी और उन्हें भविष्य में प्रयोग के लिए एक सूखी कंटेनर (एक बार सूखी वे खड़ी हो सकता है है) में रखना.

बी coverslips को संलग्न कोशिकाओं

गैर पक्षपाती कोशिकाओं (यहाँ हम K562 कोशिकाओं का उपयोग करें)

  1. एक पाली - एल Lysine 6 अच्छी तरह से लेपित सतह के साथ सामना करना पड़ रहा एक थाली में एक अच्छी तरह से लेपित coverslip रखें.
  2. बीज 7x10 5 कोशिकाओं के घनत्व पर K562 कोशिकाओं / Dulbecco संशोधित ईगल्स (DMEM) मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय (FBS) सीरम, और पी एस (पेनिसिलिन 100units/ml, स्ट्रेप्टोमाइसिन 100mg/ml) के साथ पूरक में. K562 कोशिकाओं के मामले में क्षणिक अभिकर्मक कोशिकाओं को बोने से पहले electroporation (1x10 7 250V / 975μF पर मीडिया के 200μl में कोशिकाओं के साथ 0.4cm electroporation cuvettes) का उपयोग किया जा सकता है है.
  3. 37 ° सी 5% में सीओ 2 पर 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
  4. बंद मध्यम डालो और कोशिकाओं को बर्फ के ठंडे फॉस्फेट के साथ दो बार धोने buffered खारा (पीबीएस).
  5. Subcellular fractionation प्रोटोकॉल के साथ पालन करें.

पक्षपाती कोशिकाओं (यहाँ हम क्योंकि-7 कोशिकाओं का उपयोग करें)

  1. 6 अच्छी तरह से एक थाली में एक अच्छी तरह से में uncoated coverslip रखें.
  2. पीबीएस में दो बार से धो 37 डिग्री सेल्सियस पर prewarmed
  3. 37 में पीबीएस में trypsin (0.03% EDTA, trypsin 0.25%) के साथ पचाने से कोशिकाओं को अलग ° C 2 से 5 मिनट के लिए. यह महत्वपूर्ण है नहीं कोशिकाओं से अधिक पचाने और पाचन के रूप में जल्द ही बंद के रूप में मुख्य रूप से व्यक्तिगत अस्थायी कोशिकाओं मौजूद हैं.
  4. 3x10 5 कोशिकाओं के घनत्व में कोशिकाओं बोने / DMEM में 6 अच्छी तरह से 10% FBS और पीएसजी (पेनिसिलिन 100 इकाइयों / एमएल, स्ट्रेप्टोमाइसिन 100ug/ml और एल glutamine 292ug/ml) के साथ पूरक एक थाली में अच्छी तरह से पाचन बंद करो सामान्य coverslips पर. पक्षपाती कोशिकाओं को आम तौर पर सामान्य खुर्दबीन coverslips पर अच्छी तरह से देते हैं, तथापि, पाली एल Lysine लेपित coverslips यदि आवश्यक में इस्तेमाल किया जा सकता है.
  5. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं. क्योंकि-7 कोशिकाओं के मामले में क्षणिक अभिकर्मक 6 Fugene (Roche) और यदि आवश्यक हो तो 37 पर एक और आगे 24 घंटे के लिए ठीक करने के लिए छोड़ दिया कोशिकाओं का उपयोग किया जा सकता है है डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
  6. बंद मध्यम डालो और कोशिकाओं को बर्फ के ठंडे पीबीएस के साथ दो बार धोने.
  7. Subcellular fractionation प्रोटोकॉल के साथ पालन करें.

द्वितीय. Subcellular fractionation

सीटू अंश में योजनाबद्ध चित्र 1 में दिखाया के अनुसार किया जाता है और एक पद्धति पर आधारित है के साथ 5 पहले से वर्णित संशोधनों 7 पहले और नीचे विस्तृत प्रोटोकॉल में वर्णित है. यह एक ताजा 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए coverslips प्रत्येक fractionation तरल हटाने से पहले coverslip हटाने के कदम के बाद स्थानांतरण की सिफारिश की है. हालांकि केवल चार coverslips इमेजिंग के लिए आवश्यक हैं, अतिरिक्त coverslips पूरे सेल और पश्चिमी सोख्ता अगर यह समानांतर में प्रदर्शन किया है के लिए निकालने परमाणु मैट्रिक्स भिन्न उत्पादन के लिए आवश्यक हैं.

  1. तैयार है और cytoskeleton (CSK) बफर फिल्टर: 10mm पाइप, 300mm Sucrose, 100mm NaCl, 3mm 2 MgCl, 1mm EGTA. CSK बफर हौसले fractionation के दिन पर तैयार रहना चाहिए.
  2. यदि आवश्यक एक coverslip से कोशिकाओं धीरे coverslip पर सीधे 200ul TES बफर (1% एसडीएस, 2mm EDTA, 20mm Tris - एचसीएल पीएच 7.4) रखने और 1 या 2 मिनट के लिए incubating सोख्ता पश्चिमी के लिए पूरे सेल निकालने को तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 22 में डिग्री सेल्सियस पूरे सेल निकालने और फिर से हटाया जा सकता है 1M के 250ul (एनएच 4) 2 अतः 4 जोड़ने और जब तक अन्य पश्चिमी नमूने तैयार कर रहे हैं बर्फ पर incubating प्रोटीन उपजी हो.
  3. 1ml बर्फ ठंड पीबीएस के साथ शेष coverslips दो बार 22 डिग्री सेल्सियस झुकने द्वारा 6 अच्छी तरह से थाली दो या तीन बार धो.
  4. पूरे कोशिकाओं और एक ताजा 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए स्थानांतरण का प्रतिनिधित्व coverslip निकालें. सेल निर्धारण और इम्युनो - प्रतिदीप्ति प्रोटोकॉल के साथ पालन करें.
  5. धीरे शेष कुओं से पीबीएस हटायें.
  6. धीरे 200ul CSK बफर रखकर cytoplasmic और शिथिल आयोजित परमाणु प्रोटीन निकालें + 0.1% (वी / वी) ट्राइटन पर प्रत्येक शेष coverslip पर सीधे X-100 और incubating1 मिनट के लिए बर्फ.
  7. Cytoplasmic और शिथिल आयोजित परमाणु निकालने निकालें और वेग के रूप में चरण 2 में वर्णित.
  8. 1ml बर्फ ठंड पीबीएस के साथ coverslips दो बार 22 ° 6 अच्छी तरह से थाली झुकने से सी धो.
  9. कसकर आयोजित परमाणु सामग्री का प्रतिनिधित्व coverslip निकालें और सेल निर्धारण और इम्युनो - प्रतिदीप्ति प्रोटोकॉल के साथ पालन करें.
  10. धीरे शेष कुओं से पीबीएस हटायें तो धीरे + 0.5% (वी / वी) ट्राइटन X-100 प्रत्येक शेष coverslip पर सीधे 200ul CSK बफर रखने और 20 मिनट के लिए बर्फ पर incubating कसकर आयोजित प्रोटीन निकाल सकते हैं.
  11. कसकर आयोजित निकालने निकालें और वेग के रूप में चरण 2 में वर्णित.
  12. 1ml बर्फ ठंड पीबीएस के साथ coverslips दो बार 22 ° 6 अच्छी तरह से थाली झुकने से सी धो.
  13. Chromatin अंश का प्रतिनिधित्व coverslip निकालें और सेल निर्धारण और इम्युनो - प्रतिदीप्ति प्रोटोकॉल के साथ पालन करें.
  14. धीरे शेष कुओं से पीबीएस हटायें जगह तो 200ul CSK + बफर 100ug/ml मैं DNase के शेष 30 मिनट के लिए और coverslips सेते पर 37 डिग्री सेल्सियस
  15. Chromatin निकालने निकालें और वेग के रूप में चरण 2 में वर्णित.
  16. बर्फ के ठंडे पीबीएस के साथ coverslips धो दो बार 22 डिग्री सेल्सियस झुकने से 6 अच्छी तरह से थाली पर.
  17. परमाणु मैट्रिक्स अंश का प्रतिनिधित्व coverslip निकालें और सेल निर्धारण और इम्युनो - प्रतिदीप्ति प्रोटोकॉल के साथ पालन करें.
  18. यदि आवश्यक हो मैट्रिक्स प्रोटीन पश्चिमी के लिए एक अतिरिक्त मैट्रिक्स coverslip 200ul TES बफर का उपयोग कर के रूप में चरण 2 में वर्णित सोख्ता से हटाया जा सकता है.
  19. पश्चिमी धब्बा के लिए नमूने 4 पर एक बेंच शीर्ष microcentrifuge में 13,000 rpm पर centrifuged होना चाहिए डिग्री सेल्सियस और छर्रों 40ul एसडीएस लोड हो रहा है बफर (62.5mM Tris - एचसीएल 6.8 पीएच, एसडीएस 2% (w / v), 50 मिमी डीटीटी में resuspended, 10% ग्लिसरॉल, एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण से पहले 0.01% bromophenol नीले (w / v)).
    चित्रा 1
    चित्रा 1. सीटू subcellular fractionation में एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व cytoskeleton बफर (CSK). 10mm पाइप, 300mm Sucrose, 100mm NaCl, 3mm 2 MgCl, 1mm EGTA के होते हैं. TES बफर 1% एसडीएस, 2mm EDTA, 20mm Tris - एचसीएल पीएच 7.4 के होते हैं.

III. सेल निर्धारण और इम्युनो - प्रतिदीप्ति

  1. धीरे 30 मिनट के लिए प्रत्येक coverslip और 4 में सेते ° सी 4% formaldehyde / पीबीएस के 1ml जोड़ने.
  2. प्रत्येक coverslip धीरे पीबीएस के 1ml के साथ 22 पर 2-3 बार ° सी. धो
  3. प्रत्येक coverslip और 10 मिनट के लिए 22 ° C पर सेते 0.1% ट्राइटन X-100/PBS के 400ul जोड़ें.
  4. प्रत्येक coverslip धीरे पीबीएस के 1ml के साथ 22 पर 2-3 बार ° सी. धो
  5. 22 ° C पर 20 मिनट के लिए 3% गोजातीय सीरम albumin (BSA) / PBS और सेते 400ul के लिए संभावित पृष्ठभूमि धुंधला को कम करने में जोड़ें.
  6. प्रत्येक coverslip धीरे पीबीएस के 1ml के साथ 22 पर 2-3 बार ° सी. धो
  7. पीबीएस में प्राथमिक एंटीबॉडी के coverslip और 1 घंटे के लिए सेते 22 ° C पर सीधे पर प्लेस 100ul. पीबीएस में प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी आवश्यक एकाग्रता के लिए पतला होना चाहिए. यह प्रत्येक इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के लिए अनुकूलित किया जा आवश्यकता हो सकती है.
  8. प्रत्येक coverslip धीरे पीबीएस के 1ml के साथ 22 पर 2-3 बार ° सी. धो
  9. पीबीएस और सेते में माध्यमिक एंटीबॉडी के 22 ° सी दूर से 1 घंटे के लिए प्रकाश प्लेस 200ul.
  10. प्रत्येक coverslip धीरे पीबीएस के 1ml के साथ 22 पर 2-3 बार ° सी. धो
  11. एक गिलास खुर्दबीन Vectashield बढ़ते DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole हाइड्रोक्लोराइड) युक्त माध्यम का उपयोग कर स्लाइड पर माउंट प्रत्येक coverslip (कोशिकाओं).
  12. एक कागज तौलिया का उपयोग कर coverslip के आसपास से अधिक बढ़ते मध्यम पोछो और 22 ° C पर कम से कम 30 मिनट के प्रकाश से दूर के लिए स्लाइड सेते हैं.
  13. Coverslip गिलास स्लाइड स्पष्ट ऐक्रेलिक नेल पॉलिश का उपयोग करने के लिए फिक्स.
  14. स्लाइड्स प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा दृश्य से पहले प्रकाश से दूर रखें.

चतुर्थ. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 2
चित्रा 2. गैर ट्रांसफ़ेक्ट COS-7 कोशिकाओं के Subcellular fractionation खंडित कोशिकाओं क्योंकि-7. Formaldehyde के साथ तय किया गया और α-ट्यूबिलिन, α-H1 histone या α-lamin ए / सी TRITC को संयुग्मित एंटीबॉडी बढ़ते मध्यम के साथ इलाज के द्वारा पीछा किया DAPI युक्त का उपयोग immunostained . छवियाँ 10x नेत्र लेंस और 63x उद्देश्य लेंस एक Leica confocal खुर्दबीन का उपयोग कर के साथ हासिल किया गया. सेल नाभिक एक DAPI फ़िल्टर सेट का उपयोग करते हुए एक ही क्षेत्र मार्कर एंटीबॉडी के साथ दाग कोशिकाओं में visualized थे एक TRITC फ़िल्टर सेट का उपयोग कल्पना थे.

चित्रा 3
चित्रा 3. GFP-6E2 संलयन परमाणु मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ जुड़ा हुआ है. क्योंकि सात एक संलयन हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) मानव papillomavirus (एचपीवी) टाइप 6 इनकार से मिलकर प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं के Subcellular fractionationE2 प्रोटीन (GFP-6E2). सेल नाभिक DAPI धुंधला हो जाना के माध्यम से कल्पना थे जबकि GFP-6E2 के ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में स्थानीयकरण सीधे GFP प्रतिदीप्ति के माध्यम से कल्पना की थी. एक सी / lamin ए / सी TRITC और एक TRITC फ़िल्टर सेट संयुग्मित एंटीबॉडी α-lamin का उपयोग कल्पना था. मर्ज छवियों से पता चलता है कि GFP-6E2 प्रोटीन के कुछ परमाणु मैट्रिक्स (निचले सही पैनल) के साथ जुड़ा हुआ है. छवियाँ चित्रा 2 में वर्णित के रूप में प्राप्त थे.

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Discussion

आम समस्याओं और सुझावों:

सभी या कक्षों की सबसे धोने के दौरान खो रहे हैं. धोने चरणों के दौरान तरल पदार्थ 6 अच्छी तरह से थाली coverslip परहेज के पक्ष में धीरे जोडी चाहिए. इसी तरह तरल पदार्थ सावधानी झुकाव प्लेट द्वारा हटाया जाना चाहिए और धीरे धीरे से अधिक तरल पदार्थ pipetting सेल आसंजन पाली एल Lysine लेपित coverslips का उपयोग बढ़ाया जा सकता है है.

जीनोमिक डीएनए पूरी तरह से नहीं पचता है. कुछ प्रकार की कोशिकाओं के लिए DNase मैं पाचन कदम बढ़ाया और / या DNase मैं एकाग्रता बढ़ क्रम में जीनोमिक डीएनए की पूरी हटाने को प्राप्त करने की आवश्यकता हो सकती है.

फिक्सेशन और fractionation कलाकृतियों. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि कुछ प्रोटीन निर्धारण या 6 fractionation के दौरान relocalize कर सकते हैं है. उदाहरण के लिए परमाणु झिल्ली के नाभिक निम्नलिखित व्यवधान से जारी प्रोटीन साइटों है कि अन्यथा अच्छी तरह से अलग डिब्बों में स्थित होगा करने के लिए बाध्य कर सकते हैं. इन प्रभावों को प्राप्त परिणामों की तुलना formaldehyde के स्थान paraformaldehyde का उपयोग उदाहरण के लिए विभिन्न निर्धारण के तरीकों का उपयोग कर के द्वारा कम किया जा सकता है. लाइव सेल इमेजिंग भी पूरे कक्षों में कम से कम 3 के लिए सहायक हो सकता है है.

इस तकनीक को अच्छी तरह से GFP संलयन प्रोटीन का पता लगाने के के लिए अनुकूल है. हालांकि, यह पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है कि संलयन प्रोटीन untagged प्रोटीन के लिए एक समान तरीके से बर्ताव करता है. यह भी महत्वपूर्ण है अनुमापन द्वारा पुष्टि करते हैं कि प्रोटीन तुलनीय स्तर पर व्यक्त कर रहे हैं प्रोटीन पर अभिव्यक्ति के बाद से नाटकीय रूप से उप सेलुलर स्थानीयकरण बदल सकते हैं.

तकनीक के अनुप्रयोग:

यह underutilized तकनीक प्रोटीन स्थानीयकरण अलग subcellular डोमेन या संरचनाओं की अच्छी तरह से विशेषता मार्करों के लिए संदर्भ के साथ निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है और कोशिका जीव विज्ञान के कई क्षेत्रों में आवेदन किया है. उदाहरण के लिए, कई प्रतिलेखन कारकों cytoplasm के लिए स्थानीयकरण के साथ एक जटिल वितरण, शिथिल आयोजित nucleoplasm, chromatin और / या परमाणु 1,2,4 मैट्रिक्स प्रदर्शित करते हैं. इन डोमेन में से प्रत्येक में स्थानीयकरण प्रोटीन के रूप में अच्छी तरह के रूप में प्रोटीन कारोबार और बाद translational संशोधनों समारोह को प्रभावित कर सकते हैं.

परमाणु मैट्रिक्स के रूप में विशिष्ट डोमेन के लिए सह स्थानीयकरण प्रोटीन प्रोटीन समारोह में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. विशिष्ट संकेतों और / या साथी प्रोटीन की अभिव्यक्ति के जवाब में फिर स्थानीयकरण प्रोटीन प्रोटीन समारोह 1,4 पर भी प्रकाश डाला कर सकते हैं.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

Anyaporn Sawasdichai और Nazefah अब्दुल हमीद रायल थाई सरकार और मलेशिया सरकार के लिए आभारी क्रमशः पीएच.डी. के लिए छात्रवृत्ति. यह काम एक वेलकम ट्रस्ट परियोजना PSJ और केजी के लिए सम्मानित किया अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था. हम भी हैं के ब्रिस्टल वोल्फसन Bioimaging सुविधा के विश्वविद्यालय के लिए आभारी हैं.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
BSA Chemical Sigma-Aldrich A9647-100G
DNase I Chemical Sigma-Aldrich DN25-1G
poly-L-Lysine Chemical Sigma-Aldrich P-8920
Trypsin Chemical
EGTA Chemical Sigma-Aldrich E4378-25G
Fomaldehyde Chemical VWR 284216N
PIPES Chemical Sigma-Aldrich P-6757
Sucrose Chemical Fisher Scientific S/8600/53
Triton X-100 Chemical Sigma-Aldrich T-6876
Mounting Medium with DAPI Chemical Vector Laboratories H-1200
Fugene 6 Transfection Reagent Chemical Roche Group 11814443001
Histone H1 Antibodies Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-8030
Lamin A/C Antibodies Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-20681
Tubulin-α Antibodies Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-32293

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References

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