Undersökning av Telomer G-överhäng Struktur i Trypanosoma brucei

Immunology and Infection
 

Summary

Telomererna är avgörande för kromosom stabiliteten och telomeren G-överhäng struktur är viktigt för telomeras-medierad telomer underhåll. Vi har nyligen antagit två metoder för att upptäcka telomeren G-överhäng struktur i

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sandhu, R., Li, B. Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei. J. Vis. Exp. (47), e1959, doi:10.3791/1959 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den telomeren G-överhäng struktur har identifierats i många eukaryoter, inklusive jäst, ryggradsdjur, och Trypanosoma brucei. Det fungerar som substrat för telomeras för de novo telomer-DNA syntes och är därför viktig för telomererna underhåll. T. brucei är en protozo parasit som orsakar sömnsjuka hos människor och nagana hos nötkreatur. När smittade däggdjur värd, T. brucei cellen byter regelbundet sina ytantigen att undkomma värdens immunförsvar attack. Vi har nyligen visat att T. brucei telomeren struktur spelar en viktig roll i regleringen av ytantigen genuttryck, vilket är avgörande för T. brucei patogenes. Men T. brucei telomeren struktur har inte studerats på grund av begränsningar i metoder för analys av denna specialiserade struktur. Vi har nu framgångsrikt antagit de infödda i-gel hybridisering och ligation-medierade primer metoder förlängning för undersökning av telomer G-överhäng struktur och en adapter ligation metod för bestämning av telomer terminalen nukleotid i T. brucei celler. Här kommer vi att beskriva de protokoll i detalj och jämföra deras olika fördelar och begränsningar.

Protocol

1. Identifiera T. brucei Telomer G-överhäng med personen i-gel hybridisering 3

Princip (Figur 1): Under infödda tillstånd, ett end-märkta (CCCTAA) 4 (TELC) oligo sond kan bara hybridisera till enkelsträngat telomer G-överhäng regionen. Den hybridisering intensitet är proportionell mot längden på överhäng. Efter denaturering och neutralisering, kommer samma sonden kunna hybridisera till hela telomeren regionen. Den hybridisering intensitet motsvarar det totala belopp telomer-DNA och kan användas som en belastning kontroll. Två standard kontroller för detta experiment är hybridisering med end-märkta (TTAGGG) 4 (TELG) oligo sond, som inte bör ge någon signal som T. brucei cell har inte telomer C-överhäng struktur, och för att behandla arvsmassans DNA med 3'-specifika enkelsträngade exonukleaser som Exo jag eller Exo T före hybridisering, vilket bör eliminera de infödda TELC hybridisering signal.

Steg 1. Förbered DNA pluggar för pulsfältgelelektrofores (PFGE)

Intakt kromosomer skall skiljas åt med PFGE. Därför är genomiska DNA som prepareras som DNA pluggar.

  1. Börja med 100 ml av celler blodomloppet form (1,5 -2.000.000 celler / ml) eller 20 ml av pro-cyklisk celler (vid 10 miljoner celler / ml).
  2. Lös upp 1,6% låg smältpunkt (LMP) agaros i L buffert (0,01 M Tris • CL pH 7,6, 0,02 M NaCl, 0,1 M EDTA pH 8,0) och håll det varmt vid 50 ° C.
  3. Harvest cellerna genom centrifugering vid 1,5 krpm, 4 ° C i 10 min. Avlägsna supernatanten och resuspendera cellpelleten med L buffert till en slutlig koncentration på 5 miljoner celler / ml.
  4. Inkubera cellsuspension vid 42-50 ° C i 10 min.
  5. Tillsätt 1 del LMP agarosen till en volym av celler. Blanda väl men snabbt.
  6. Alikvotera 85 mikroliter cellsuspension i varje brunn på en disponibel plugg mögel (BioRad).
  7. Efter 5-10 minuter eller tills pluggar stelnat, överföring ansluts till en 15 ml konisk tub med 5 ml L buffert / 1% Sarkosyl. Tillsätt 100 mikroliter av 250 mg / ml proteinas K eller en nypa proteinas K pulver, blanda väl och inkubera vid 50 ° C i 48 timmar.
  8. Kassera bufferten, tvätta pluggar med 5 ml L buffert två gånger och upprepa proteinas K matsmältningen i ytterligare 48 timmar. Tvätta kontakterna med färska L buffert igen. Förvara pluggar vid 4 ° C i L buffert. Dessa pluggar skall användas inom 2 veckor.

Steg 2. Separat intakt T. brucei kromosomer med hjälp av pulserande Electrophoresis Field Gel

  • Förbered agarosgel
    1. Förbered 2-3 L i 0,5 x TBE-buffert och transfer till gelen kör kammare av en kock DRII (BioRad) enhet. Ställ in driftstemperatur, starta pumpen och starta kylaggregatet.
    2. Bereda 100 ml av en 1,2% agarosgel i 0,5 x TBE-buffert. Cool agarosen medan du ställer upp gelen facket.
    3. Bestäm provets ordning. Kom ihåg att DNA-standarden. Torka av kammen och lägg det på en plan yta. Placera varje DNA-kontakten på lämpligt tanden. Ta bort överdriven buffert runt DNA-kontakten genom aspiration så pluggen fastnar på tanden.
    4. Häll agarosgel utan att sätta kammen. Låt den svalna till 40-50 ° C (några minuter), långsamt in kammen med den sticks in i gelen. Försäkra dig om att pluggarna inte glida av kammen. Låt gelen stelna. Ta bort kammen ur gelen långsamt.
  • Pulsfältgelelektrofores
    Kör gelen i en CHEF DRII enhet: 700 s-1500 s pulser, 2,5 V / cm vid 12 ° C i 120 timmar.

Steg 3. Fläcken och Avfärga agarosgelen

Fläck gelen med 1μg / ml Etidiumbromid i 0,5 x TBE vid RT för 1 timme sedan 0,5 x TBE utan Etidiumbromid för 1 timme med mjuka gungande. Ta en bild av gelen.

Steg 4. Torka agarosgel

Placera agarosgel på två lager av 3 mm Whatman papper och täck gelen med plastfolie. Torka gelen vid RT (gelen ska inte värmas över 50 ° C för att undvika denaturering av DNA-prover). Byt ut den våta Whatman tidningarna med torrt och kära efter 2 och 4 timmars torkning, respektive. Håll torkning tills gelen är helt torr. Detta kan ta över natten beroende på tork.

Steg 5. Märk oligo sonder

Blanda 1 mikroliter på 50 ng / mikroliter TELC eller TELG oligo med 1 mikroliter av 10 x polynucleotide kinas (PNK) buffert, 5 mikroliter av γ [32P] ATP, 2 mikroliter av DDH 2 O, och 1 mikroliter av T4 PNK. Inkubera vid 37 ° C under 1 timme. Tillsätt 90 mikroliter av TNES buffert (10 mM Tris Cl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, pH 8,0, 1% SDS) till reaktionsblandningen.

Även märkning av oligoes, förbereda en G-25 kolumn: sätta lite glasull i en 3 cc spruta och grejer ner det hårt med en pipettspetsen. Fyll sprutan med Sephadex G-25 böterna (autoclaved i TE) till 3 ml-markeringen. Låt det lösa i vikt. Att rena den märkta proben: last sonden på toppen av kolumnen. Tvätta med 700 mikroliter av TNES buffert, och eluera med 600 mikroliter av TNES buffert. Alternativt renar märkta sonden med hjälp av en mini Quick Spin ™ kolumn (Roche Applied Science).

Steg 6: hybridisering

  1. Kortfattat blöta torkade gelen i destillerat vatten och tvätta bort all Whatman papper fastnat på gelen
  2. Placera kiselgelen i en hybridisering påse och tillsätt 20 ml hybridiztion buffert (0,25 m Na 2 HPO 4 pH7.2, 1 mM EDTA, 7% SDS, 1% BSA, filtrerat genom 0,22 ìm filter). Inkubera i ett vattenbad vid 50 ° C med varsam gungning i minst 1 timme.
  3. Ta bort pre-hybridisering buffert. Koka den märkta sonden i 5 min och lägga till 25 ml rent hybridisering buffert, filtrera, sterilisera blanda med en 0,22 ìm spruta filter och lägg till hybridisering mixen direkt till hybridisering påsen. Förslut påsen och lägg i en grund behållare med varmt vatten. Placera hela behållaren i vattenbad. Inkubera vid 50 ° C över natten med varsam gungning.
  4. Skär en liten öppning i hybridisering påsen. Häll ut så mycket som möjligt hybridisering mix och spara den i en 50 ml koniska rör. Håll sonden frysta vid -20 ° C. Ta bort gelen från hybridisering påsen och placera den i en behållare.

    I detta steg kommer allt att vara heta och BEHOV omfattande rengöring (bänk, SCREEN, saxar, ETC. SE TILL ATT HA dubbla lager av handskar!
  5. Tvätta gelen i 4 x SSC för 30 min vid 50 ° C. Ersätt med färska tvättbuffert och upprepa två gånger.
  6. Tvätta gelen i 4 x SSC/0.1% SDS vid 50 ° C.
  7. Sätt gelen på en bit 3 mm Whatman papper och lätt torra gelen.
  8. Linda gelen med plastfolie och utsättas för phosphorimager för ~ 3 dagar
  9. Skanna phosphorimager
  10. Inkubera gelen i denatureringen buffert (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH) vid RT i 30 min
  11. Tvätta gelen i neutralisering buffert (3 M NaCl, 0,5 M Tris • / Cl pH 7,0) vid RT i 30 min
  12. Skölj i destillerat vatten i 3 min
  13. Pre-hybridisera vid 55 ° C under 1 timme
  14. Upprepa hybridisering med samma sond som innehåller hybridisering blandning vid 55 ° C över natten.
  15. Tvätta enligt ovan, utom vid 55 ° C.
  16. Linda gel och utsättas för phosphorimager för ~ 2 timmar.
  17. Skanna phosphorimager. Normalisera hybridisering signalen inhämtas före denaturering med den som erhålls efter denaturering.

2. Bestäm Telomer Terminal Nukleotid genom Adapter Ligation 6

Princip (Figur 2A och 2B): En 5 "end-märkt unik oligonukleotid är knyts ihop till 3 'änden av G-överhäng. Detta sker genom glödgning till specifika kompletterande handledning oligo. Endast unika / guide oligo-adapter med sekvenser kompatibel med telomeren G-överhäng terminalen sekvenser blir knyts ihop. För T. brucei kan telomerer sluta i ett av sex olika nukleotider i TTAGGG upprepas. Därför sex olika guide oligoes används (TG1-TG6, figur 2A). Efter ligation är DNA kokas tillsammans med restriktionsendonukleaser och lösas på en agarosgel.

  1. Kinase behandling av unika oligo.
    Blanda 6 mikroliter av 10 pmole / mikroliter unika oligo med 3 mikroliter av 10x PNK Buffer, 5 mikroliter av γ [32 P] ATP, 14 mikroliter av DDH 2 O, och 2 mikroliter (10 U) av T4 PNK. Inkubera blandningen vid 37 ° C under 1 timme.
  2. Ta bort unincorporated heta nukleotid.
    Använd Qiaquick nukleotid borttagning kit för att ta bort oregistrerade heta ATP och eluera slut-märkta oligo med 60 mikroliter av Elution Buffer (slutlig koncentration skulle vara ~ 1 pmole / l).
  3. Glödga unika oligo att vägleda oligo (för att skapa adapter).
    Tillsätt 10 mikroliter av renat unika oligo till 2 mikroliter av varje guide oligo och 1 mikroliter glödgning buffert (200 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 8,0). Lägg rören i en 85 ° C värmeblock och stäng av värmen blocket. Låt rören och värmeblocket coolt att RT. Detta tar några timmar. Om bråttom, överföringsröret efter 5 min vardera till 65 ° C, därefter 37 ° C och sedan låta den svalna till RT.
  4. Ligate adaptrar till total genomiska DNA.
    Till 2,5 mikroliter av intakta genomiska DNA, tillsätt 4 mikroliter av 5 x ligas buffert, 10 mikroliter av glödgad oligos, 2,5 mikroliter av DDH 2 O, och 1 mikroliter av T4 DNA-ligas. Inkubera vid 16 ° C över natten.
  5. Begränsning Endonuclease Digestion
    Till 20 mikroliter av ligation produkten lägga 3 mikroliter av 10 x NEB buffert 4, 1,5 mikroliter av AluI och MboI vardera, och 4 mikroliter av DDH 2 O. Inkubera blandningen vid 37 ° C över natten.
  6. Elektrofores.
    Tillsätt 3 mikroliter av 10 x Orange G färgämne (50% glycerol, 0,5% Orange G) till varje prov. Ladda DNA-prov på en 20x20 cm 0,7% agarosgel i 0,5 x TBE med 0,2 mikrogram / ml Etidiumbromid. Kör vid 30V i 30 min, sedan cFortsätta att med högre spänning, men mindre än 120V till totalt 1000 mot HR. Ta en bild av gelen med en linjal bredvid DNA-markör.
  7. Torr gel och exponera.
    Sätt agarosgel på ett skikt av DE81 filtrerpapper och två lager av 3 mm Whatman papper och täck gelen med plastfolie. Torka gelen vid RT. Exponera torkade gelen phosphorimager natten.

3. Ligatur Medierad Primer Extension 6

Princip (Figur 2A och 2C): En unik oligonukleotid är knyts ihop till 3 G-överhäng med specifik terminal sekvens, bestäms av dess komplementära sekvenser i adaptern (guide) oligo. Efter rening är märkt guide oligo som återstår anlöpt till G-overhang/unique oligo primer utsträckas till SS-ds korsningen med T4 DNA-polymeras, som saknar sträng förskjutning och 5'-3 verksamhet exonuclease. Grundfärgen förlängningen produkter ger därmed längden på G-överhäng.

  1. Kinase behandling av guiden och unika oligoes
    1. Blanda 20 mikroliter av 10 pmole / mikroliter unika oligo med 10 mikroliter av 10 x PNK buffert, 20 mikroliter 5 x ligas buffert (som innehåller 10 mM ATP), 3 mikroliter (30 E) av T4 PNK och 47 mikroliter av DDH 2 O . Inkubera blandningen vid 37 ° C i 60 minuter.
    2. Blanda 1 mikroliter av 10 pmole / mikroliter guide oligo med 1 mikroliter av 10 x PNK buffert, 2 mikroliter av γ [32 P] ATP, 1 mikroliter (10 U) av T4 PNK och 5 mikroliter av DDH 2 O. Inkubera blandningen vid 37 ° C i 60 minuter.
  2. Glödga guide oligo och unika oligo
    Tillsätt 10 mikroliter (20 pmole) av fosforyleras unika oligo och 10 mikroliter (10 pmole) i slutet märkt guide oligo i ett 1,5 ml Eppendorf-rör (det förhållandet 2:1 av unika att vägleda oligo säkerställer att all vägledning oligo är glödgad ). Följ samma procedur som beskrivs i protokoll II för glödgning oligoes.
  3. Ligate glödgat guide / unika oligo adapter till telomer slutar
    Följ samma procedur som beskrivs i protokoll II för DNA ligatur.
  4. Fällning DNA med 1 / 10 volymen av natriumacetat och 2,5 volym iskall etanol -80 ° C i 30 min. Spinn ner DNA pellets vid 12 krpm, 4 ° C i 15 min. Tvätta DNA med 70% etanol och lös pall i 10 mikroliter av DDH 2 O.
  5. Primer förlängning
    Till varje 10 mikroliter DNA-provet och tillsätt 2 mikroliter av 10 x T4 DNA-polymeras buffert, 1 mikroliter av 1 mg / mL BSA, 1 mikroliter 25 mm dATP, dCTP och dTTP vardera, 1 mikroliter (3 U) av T4 DNA-polymeras, och 3 mikroliter av DDH 2 O.
    Gör en mästare blandas med polymeras, buffert, etc. och delprov anslag från Master Mix till varje DNA-prov. Inkubera vid 30 ° C i 30 min. Tillsätt sedan 1,2 mikroliter av 0,5 M EDTA omedelbart till reaktionen.
  6. Elektrofores
    Kör förlängning produkter på en 10% akrylamid / 7 M urea/1xTBE gel. Ladda 4 mikroliter i varje prov. Koka proverna i 10 minuter innan lastning. Köras på 800V i 1x TBE tills den blå färgen når botten av gelen. Torka gelen vid 65 ° C i 30 minuter därefter på RT i 30 min och utsättas för phosphorimager i 2 timmar.
    För att bereda 100 ml 10% polyakrylamidgel, lös upp 41 g urea och 21 ml 40% akrylamid lösning (akrylamid / BIS-akrylamid 29:1) i 30 ml destillerat vatten, tillsätt 10 ml av 10x TBE. Montera glasplåtar. Precis innan häller gelén, tillsätt 1 ml 10% APS och 100 mikroliter av TEMED. Häll gelen och försök att undvika bubblor.

4. Representativa resultat:

Identifiera T. brucei telomeren G-överhäng struktur med hjälp av inbyggda i-gel hybridisering

Intakt T. brucei kromosomer separerade med PFGE visas i figur 3A och 3B (vänster paneler). T. brucei celler innehåller normalt ~ 100 exemplar som han sedan, alla med liknande storlek (50-150 kb) och migrera till samma position på gelen (MC). På grund av detta faktum, efter hybridisering med TELC oligo sonden, telomer G-överhäng signal är mest framträdande på som han sedan (Figur 3A, mellersta panelen). Hybridisering med TELG oligo prob normalt inte ger någon hybridisering signal (Figur 3B, mitten panel) eftersom T. brucei celler inte har telomer C-överhäng struktur. Efter denaturering och neutralisering, hybridisering med antingen TELC eller TELG oligo sond bör avslöja telomer signaler på alla kromosom ändar (figur 3A och 3B, höger sida).

Bestäm telomeren terminalen nukleotid av adapter ligering

Laddar lika mycket DNA i varje körfält är en förutsättning för denna analys, och detta visas av etidiumbromid färgning av gelen. Ett exempel visas i figur 4A, vänstra panelen.

I detta protokoll är slut-märkta unika oligo och vägleda oligo adaptrar bara knyts ihop till kromosom slut när telomeren G-överhäng som slutar med sekvenser som är kompatibla med guiden oligo. SI NCE den unika oligo är slut-märkt, kommer ligation produkten vara radioaktivt och ger stark signal. Som visas i figur 4A, högra panelen ger körfält 1 en stark signal, vilket indikerar att en stor mängd unique/TG1 Adaptern har knyts ihop till telomeren slutet. TG1 har ett slut sekvens av 5'CCCTAA3 ". Därför telomeren G-överhäng knyts ihop med denna adapter sluta i 5'TTAGGG3 ". Inga betydande ligation produkter observeras med andra guide oligoes, vilket indikerar att telomererna slutar på TTAGGG dominerar i T. brucei celler.

Behandla arvsmassans DNA med Exo I eller Exo T, som är 3 "överhäng specifika nukleaser, resulterade i förlust av ligation produkter (figur 4A, högra panelen körfält 2 och 3), indikerar att ligation verkligen berodde på telomeren G- överhäng struktur

Ligatur Medierad Primer Extension

Utan ligation är slut-märkt guide oligo 22 nt lång. Laddar slut-märkt guide oligo skulle fungera som en negativ kontroll och en storlek markör. (Figur 4B, Lane 11, anger asterisk slut-märkt guide oligo). Vi normalt också iaktta ett band av ~ 44 nt i negativ kontroll (Figur 4B, Lane 11, öppen triangel), som är mest sannolikt rester odenaturerat adaptrar. Efter ligering av kromosom slutet, speglar den utvidgade produkten längden på G-överhäng struktur. De flesta T. brucei telomeren G-överhäng slut i 5'TTAGGG3 "(Figur 4A). Men dessa G-överhäng verkar vara mycket kort (bara ~ 10 nt lång), som produkter sträckte sig från knyts ihop TG1 guiden oligo är inte mycket längre än de vägledande oligo själv (Figur 4B, Lane 10), men de tillåter ligation av TG1-adapter (Figur 4A, höger panel, körfält 1). Även om bara en liten mängd TG4 adapter var knyts ihop till telomeren ändarna (Figur 4A, högra panelen körfält 6), produkter förlängts från knyts ihop TG4 är mycket längre (Figur 4B, 7 körfält, pilar), med den längsta produkten ~ 55 NT. Därför observerade vi två typer av telomer G-överhäng i T. brucei celler. Den dominerande telomeren G-överhäng slut i 5'TTAGGG3 "men är endast ~ 10 nt lång. Få telomeren G-överhäng slut i 5'GGGTTA3 "men kan upp till 40 nt lång. Båda typerna av G-överhäng är känsliga för Exo T (eller Exo I) behandling (Figur 4A, höger panel, 2 körfält, 3 och 7, figur 4B, körfält 1, pilar).

Figur 1
Figur 1. Principen om infödda i-gel hybridisering. Vänster, under den ursprungliga tillstånd, slut-märkt TELC oligo sond bara kan hybridisera med enkelsträngat G-rika telomer överhäng. Intensiteten i hybridisering speglar längden på telomererna G-överhäng. Höger, efter denaturering kommer TELC oligo sonden hybridisera med alla telomer-DNA. Intensiteten i denna hybridisering representerar den totala mängden telomer-DNA och används som en belastning kontroll, och den slutliga G-överhäng nivå beräknas genom att dividera de infödda hybridisering signal genom att den som erhålls efter denaturering.

Figur 2
Figur 2. Principen om Adapter ligation och ligation medierade primer förlängning. (A) Sekvenser av den unika och sex guide oligoes. (B) Bestäm telomeren terminalen nukleotid av adapter ligatur. Den unika oligo är slut-märkt (markerad med en röd asterisk), anlöpt till guiden oligoes och knyts ihop till telomeren slutet. Först när en unik guide / adapter bär en 3 "överhäng som är kompatibel med terminalen telomer sekvensen kommer adaptern att knyts ihop. (C) i ligation medierad primer förlängning, är guiden oligo end-märkta (markerad med en röd asterisk) och anlöpt till den unika oligo innan knyts ihop av kromosom slutar. Endast unika / guide adapter med en 3 "överhäng kompatibel med G-överhäng blir knyts ihop. ^ Indikerar knyts ihop phophordiester obligationen. Efter avlägsnande av unligated oligo paren kommer primer förlängning ske med T4 DNA-polymeras, som saknar sträng förskjutning och 5'-3 verksamhet exonuclease. Den slutliga längden på den förlängda guiden oligo avspeglar därför längden på G-överhäng.

Figur 3
Figur 3. T. brucei telomeren G-överhäng struktur analyseras av infödda i-gel hybridisering. (A) i-gel hybridisering med TELC oligo sond. (B) i-gel hybridisering med TELG oligo sond. I båda (A) och (B) vänster, Ethedium Bromid färgade PFG. Mellanöstern, infödda hybridisering resultat. Höger, efter denaturering hybridisering resultat. Vildtyp T. brucei celler har använts. Intakt eller Exo Jag behandlade arvsmassans DNA var separerade med PFGE. Öppna triangel står för megabase kromosomerna, IC, mellanliggande stora kromosomer, MC, som han sedan.

"/>
Figur 4. T. brucei telomeren G-överhäng struktur analyseras av ligation-medierad primer förlängning. (A) De flesta T. brucei telomeren G-överhäng avslutas med 5'TTAGGG3 ". Vänster, Ethedium bromid färgade DNA-gel. Ungefär lika mängd DNA laddas i varje körfält. Höger, exponering på grund av samma gel efter torkning. Intakt, Exo I-behandlade, eller Exo T-behandlade DNA knyts ihop till sex olika slut-märkt unik / guide oligo-adaptrar som anges. (B) T. brucei telomererna har kort G-överhäng. Intakt eller Exo T-behandlade genomiska DNA knyts ihop till sex olika unika / guide oligo adaptrar följt av primer förlängningen använda T4 DNA-polymeras. End-märkt TG4 oligo var lastad som negativ kontroll (Lane 11). Den oligo själv kör på 22 NT (*), men gav också en svagare signal vid ~ 44 NT (Δ). Endast unique/TG4 adapter gav förlängning produkter betydligt längre än de vägledande oligo själv (pilar, körfält 7).

Discussion

Trypanosoma brucei orsakar sömnsjuka hos människor. Denna sjukdom, om den lämnas obehandlad, oundvikligen till döden. T. brucei celler i däggdjur värd genomgår antigen variation regelbundet så att kringgå värdens immun attack 7. Därför är det mycket svårt att eliminera T. brucei celler när en infektion är etablerad. Vi har nyligen visat att telomererna spelar en viktig roll i regleringen av uttrycket av T. brucei ytantigen gen 8. Därför är det viktigt att ytterligare förstå funktioner telomerer och mekanismerna för telomeren underhåll i T. brucei celler.

Den telomeren G-överhäng struktur är viktigt för telomeras medierad telomer underhåll 5. Metoder för mätning av telomeren överhäng längder är värdefulla för att studera mekanismer telomer underhåll. Vi har framgångsrikt antagit de infödda i-gel hybridisering 3 och ligation-medierade primer förlängning 6 metod för analys av T. brucei telomeren G-överhäng struktur och adapter ligation metod för bestämning av telomererna terminal nukleotid. Såväl infödda i-gel hybridisering och adaptern ligation metod kan avslöja den totala mängden G överhäng i cellen, men bara ligation medierad primern förlängningen kan avslöja den exakta längden G överhäng.

För infödda i gel hybridisering, är det viktigt att inte denaturera DNA-provet under hela förberedelsearbetet steg. Detta kan kontrolleras genom hybridisering DNA med TELG oligo sond. Eftersom det inte finns någon telomer C-överhäng bör infödda TELG hybridisering ger inte någon signal om inte proverna är delvis denaturerad. Provet ska också användas inom två veckor som telomeren G-överhäng är mycket känslig för alla nukleas aktivitet.

För adaptern ligatur och primer förlängning, renat oligoes ge tydligare resultat. Exo T är mer effektivt än Exo jag för klyva 3 specifika enkelsträngat överhäng DNA. Lika lastning av glödgade proverna är viktiga för kvantifiering av den totala mängden telomer G-överhäng.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Vi vill tacka Dr Carolyn Pris för vetenskapliga diskussioner och förslag insiktsfulla. Detta arbete stöds av NIH bidrag AI066095 (PI: Bibo Li).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SeaKem LE Agarose Lonza Inc. 50004
Agarose Type VII (low melting agarose) Sigma-Aldrich A4018
Proteinase K, recombinant, PCR grade Roche Group 03 115801001
Exo I New England Biolabs M0293
Exo T New England Biolabs M0265
T7 exonuclease New England Biolabs M0263
T4 DNA polymerase New England Biolabs M0203
QIAquick nucleotide removal kit Qiagen 28304

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Munoz-Jordan, J. L., Cross, G. A., de Lange, T., Griffith, J. D. t-loops at trypanosome telomeres. EMBO J. 20, 579-588 (2001).
  2. Li, B., Espinal, A., Cross, G. A. M. Trypanosome telomeres are protected by a homologue of mammalian TRF2. Mol Cell Biol. 25, 5011-5021 (2005).
  3. Wellinger, R. J., Wolf, A. J., Zakian, V. A. Saccharomyces telomeres acquire single-strand TG1-3 tails late in S phase. Cell. 72, 51-60 (1993).
  4. McElligott, R., Wellinger, R. J. The terminal DNA structure of mammalian chromosomes. EMBO J. 16, 3705-3714 (1997).
  5. Harrington, L. A., Greider, C. W. Telomerase primer specificity and chromosome healing. Nature. 353, 451-454 (1991).
  6. Jacob, N. K., Skopp, R., Price, C. M. G-overhang dynamics at Tetrahymena telomeres. Embo J. 20, 4299-4308 (2001).
  7. Barry, J. D., McCulloch, R. Antigenic variation in trypanosomes: enhanced phenotypic variation in a eukaryotic parasite. Adv Parasitol. 49, 1-70 (2001).
  8. Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei. Cell. 137, 99-109 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics