Biomolecolare fluorescenza complementazione (BiFC) Assay per interazione proteina-proteina nelle cellule Cipolla Utilizzando la Helios Gun Gene

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Biology

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Summary

In questo articolo viene illustrato come utilizzare correttamente il BioRad Helios Gene Gun per introdurre DNA plasmidico in cellule epidermiche di cipolla e come test per interazioni proteina-proteina in cellule di cipolla in base al principio della complementazione bimolecolare fluorescenza (BiFC)

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Hollender, C. A., Liu, Z. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun. J. Vis. Exp. (40), e1963, doi:10.3791/1963 (2010).

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Abstract

Indagine della funzione del gene in diversi organismi si basa sulla conoscenza di come i prodotti gene interagiscono tra loro nel loro ambiente normale cellulare. La fluorescenza complementazione bimolecolare (BiFC) Assay

Protocol

I. Preparazione plasmidi

Il DNA plasmide usato per bombardamenti devono essere di purezza elevata e ad una concentrazione di 500ng/μl o superiore. Per BiFC che coinvolgono due costrutti plasmide, 25 mcg di ogni plasmide è necessario. In altre parole, 1:1 rapporto molare dei due plasmidi deve essere miscelato per dare origine a 50 mg di DNA totale plasmide per la preparazione di cartucce. Siate consapevoli che l'aggiunta di più del DNA di 50 mg può causare agglomerazione delle particelle d'oro e deve essere evitato. Disponibili in commercio i kit di estrazione del DNA plasmidico sono raccomandati per isolare DNA plasmide.

Vettori plasmidici dovrebbe essere relativamente di piccole dimensioni come pUC19. Abbiamo clonato SEU e LUH cDNA in pUC19-SPYNE e pUC19-SPYCE, rispettivamente 3. Vettori binari per la trasformazione mediata da Agrobacterium sono troppo grandi e inadeguate per il bombardamento.

II. Cartuccia preparazione

Preparazione cartuccia coinvolge particelle di rivestimento d'oro con il DNA plasmidico e di caricarli in tubi di plastica che viene successivamente tagliato in pezzi mezzo pollice di lunghezza, che può essere caricato nel titolari gene pistola cartuccia. Preparazione della cartuccia è descritto in dettaglio grande in un articolo separato Giove 4 e, quindi, non descritto qui. Per il bombardamento di cellule di cipolla, si consiglia di mescolare 50 mg di DNA plasmidico con 12,5 mg di particelle d'oro per la preparazione, che produce circa un massimo di 50 cartucce a 1 mg DNA/0.25 mg oro / cartuccia. Ogni cartuccia è per un solo colpo. Le particelle d'oro può essere sia 0,6 mm o 1,0 micron di diametro (Cat # 1652262 o Cat # 1652263; Biorad). Si consiglia inoltre di utilizzare 0,5 mg / ml soluzione PVP per la preparazione delle cartucce. Per BiFC, combinare le due DNA plasmide di ciascun partner interagire putativo nella preparazione stessa cartuccia.

Dopo la preparazione delle cartucce, è importante per testare le cartucce da sparare le cartucce appena fatto ad una pressione di elio da 150 a 200 psi Parafilm in una piazza che è avvolto intorno ad una piastra di Petri. In questo modo verificare se le particelle d'oro può essere azionato in modo efficace dalle cartucce, si dovrebbe vedere particelle d'oro debole sul Parafilm. Questo vi dà un'idea della zona che ogni colpo coprirà. Si possono notare diverse quantità di particelle d'oro spinto sulla Parafilm a diverse pressioni di elio (a 150-200 gamma psi). Se non vi è alcuna differenza significativa, scegliere la pressione più bassa per il bombardamento.

III. Tessuti cipolla Preparazione

Il giorno di riprese, staccare la pelle esterna da una grossa cipolla gialla. Utilizzando una lama di rasoio pulito e affilato, tagliate 4-5 strati profondi un'area rettangolare di circa 2 x 8 cm. Estrarre il tessuto rettangolare cipolla, scartare il due strati esterni, tagliate i restanti strati di cipolla a pezzi di circa 2x1.5 cm. Mettere i pezzi di cipolla in una capsula di Petri contenente carta da filtro (carta Whatman 3MM tagliata a cerchi) inumidito con acqua sterile. Coprire la piastra Petri e sono pronti a partire.

IV. Bombardamento

  1. Caricare le cartucce nei supporti bianchi cartuccia rotonda. Cartucce contenenti diversi costrutti plasmide deve essere caricato in diversi titolari cartuccia. Ciascun titolare di cartuccia può contenere fino a 12 cartucce per 12 scatti.
  2. Inserire la batteria e la fodera barile fresca nel Helios Gene Gun. Assicurarsi che sia il rivestimento canna e la pistola sono o-ring rispettivi allegati.
  3. In primo luogo, inserire un supporto vuoto cartuccia nella pistola del gene, con il marchio # 12 sul supporto della cartuccia verso la parte superiore della pistola. Cartuccia titolare anticipo una o due volte per assicurarsi che sia inserita correttamente.
  4. Fissare pistola al serbatoio di elio e regolare la pressione da 150 a 200 psi.
  5. Indossare protezioni per le orecchie e pistola fuoco un paio di volte con il supporto della cartuccia vuota a ripulire la camera della pistola e per assicurarsi che la pressione è stabile.
  6. Togliere il porta vuota della cartuccia e inserire un supporto caricato cartuccia. Anticipo il supporto della cartuccia in modo che la cartuccia da fuoco è posizionato in basso (06:00) del supporto della cartuccia. La ripresa di un pezzo di cipolla qui fornisce una forma di controllo negativo per fluorescenza di fondo.
  7. Luogo pezzi di cipolla nel mezzo di un piatto vuoto Petri con lo strato più interno della cipolla rivolto verso l'alto. Resto rivestimento canna del fucile gene su piastra di Petri e il fuoco della pistola tenendo premuto il pulsante laterale mentre si tira il grilletto. Trasferire la cipolla bombardato a una piastra di Petri contenente umido carta 3MM filtro.
  8. Passare alla cartuccia successiva e fuoco un altro pezzo di cipolla. Ripetere questo passaggio fino a 4-5 pezzi di cipolle vengono uccisi. Ogni pezzo cipolla è sparato una sola volta.
  9. Cambia per un supporto diverso cartuccia caricata con cartucce contenenti una diversa combinazione plasmide o diversi plasmide. Ricordatevi di cambiare il rivestimento barile unos anche per prevenire la contaminazione. Spara 4-5 pezzi di cipolla.
  10. Dopo il bombardamento, restituire tutte le cipolle a piatti Perti. Coprire le piastre di Petri con coperchi. Avvolgere con Parafilm per evitare l'essiccazione. Incubare i pezzi di cipolla a temperatura ambiente al buio per 16-48 ore.
  11. Spegnere la pressione del gas e rilasciare prima di staccare la pistola gene dal serbatoio di elio. Svitare il rivestimento barile, e rimuovere il supporto della cartuccia e le cartucce utilizzate (o non utilizzate).
  12. Pulizia titolari cartuccia e rivestimenti barile immergendo in un bicchiere con acqua saponata. Porre il becher in un bagno sonicatore e ultrasuoni per 20 minuti. Successivamente, sciacquare con acqua per eliminare tutti i residui di sapone. Ammollo in etanolo al 70% per un'ora e poi asciugarle su carta assorbente.

Osservazione V.

  1. Dopo l'incubazione pezzi di cipolla bombardato per 16-20 ore a temperatura ambiente, si può osservare GFP o YFP fluorescenza utilizzando un microscopio a fluorescenza come il Axio Zeiss Observer.z1 utilizzato in questo studio.
  2. Utilizzare pinze con estremità piatta lentamente buccia uno strato singola cellula fuori l'epidermide interna della cipolla (il livello che si affaccia direttamente la pistola durante il bombardamento). Mettere la buccia su una goccia d'acqua su un vetrino. Aggiungi coprioggetto ma attenzione a ridurre al minimo le bolle.
  3. In campo chiaro del microscopio, primo controllo per lo streaming citoplasmatica per assicurare che le cellule sono vive. Per fare questo, esporre la diapositiva alla luce campo chiaro per alcuni minuti per riscaldare il tessuto cipolla e quindi cercare plastidi in movimento. Lo streaming citoplasmatica non è sempre facile da vedere, quindi non scoraggiatevi se non riesci a vedere nessuno.
  4. Per il rilevamento a fluorescenza, l'uso appropriato di eccitazione e filtri di rilevamento per GFP o YFP. E 'importante includere controlli negativi, come pezzi di cipolla girato con un non-fluorescente plasmide. Deboli segnali giallo potrebbe apparire dalle cellule feriti, bolle d'aria, o detriti. E 'inoltre importante includere controlli positivi. Un plasmide contenente giornalista costitutivamente espresso fluorescenti come 35S:: GFP è un eccellente controllo positivo. Segnali GFP visibile dalle cellule epidermiche di cipolla (Figura 1A, D) ha indicato che le cartucce, i tessuti cipolla, e la pistola sparando gene siano adeguatamente preparati ed eseguiti. Successivamente, abbiamo osservato le interazioni tra SEU-pSPYNE e LUH-pSPYCE cipolla a pezzi bombardato con cartucce contenenti una miscela di 35S:: SEU-pSPYNE e 35S:: LUH-pSPYCE DNA. Debole fluorescenza YFP è stata osservata solo nel nucleo (Figura 1 B, E), indicando la diretta interazione fisica tra SEU e LUH che ha portato i frammenti YFP dividere insieme nel nucleo. Si noti che il segnale YFP da BiFC è significativamente più debole rispetto al segnale GFP da 35S:: GFP.

Rappresentante Risultati

Nel nostro studio ha riportato qui, il 35S:: GFP controllo positivo plasmide emana una forte fluorescenza che riempie l'intera cella, inclusi sia il nucleo e il citoplasma (Figura 1A, D). Proteina GFP è abbastanza piccolo da diffondere in nucleo, senza un segnale di localizzazione nucleare. Al contrario, SEU e LUH sono due fattori di trascrizione di Arabidopsis precedentemente dimostrato di interagire in un doppio ibrido di lievito test 2. SEU-pSPYNE (SEU fuso al frammento N-terminale di YFP) e LUH-pSPYCE (SEU fuso al frammento N-terminale di YFP), sia troppo grande per diffondere nel nucleo, contengono segnali di localizzazione nucleare 2,5. Il segnale fluorescente YFP rilevato nel nucleo della cellula cipolla (Figura 1 B, E) indica che SEU-pSPYNE e LUH-pSPYCE possono interagire in nuclei cipolla. Nessun segnale fluorescente viene rilevato cipolle bombardati con mix di pSPYNE plasmide vettore plasmidico contenente il frammento N-terminale di YFP e LUH-pSPYCE (Figura 1C, F).

Il BiFC-mediata fluorescenza YFP è significativamente più debole del fluorescenza GFP-mediata dal 35S:: GFP plasmide. Nel nostro studio, hanno anche mostrato diverse localizzazione subcellulare (cfr. Figura 1 A con B). Inoltre, il numero di cellule fluorescenti è significativamente inferiore per BiFC, come BiFC funziona solo quando entrambi i plasmidi partner di entrare con successo e sono espressi nelle cellule cipolla stesso.

Figura 1
Figura 1. Fluorescente (A, B, C) ​​e in campo chiaro (D, E, F) le immagini di cellule di cipolla bombardati da diversi costrutti di plasmide. (A) e (D), le cellule Cipolla bombardati da 35S:: GFP. GFP diffonde attraverso il citoplasma e nucleo. (B) e (E), le cellule Cipolla bombardati con eguale mescola molare di 35S:: SEU-pSPYNE (SEU fuso al frammento N-terminale di YFP) e 35S:: LUH-pSPYCE (LUH fuso al frammento C-terminale ) DNA plasmidico. Un'interazione tra SEU-pSPYNE e LUH-pSPYCE è indicato da un nucleo fluorescente. (C) e (F), un controllo negativo che mostra cellule cipolla bombardati da miscele di vettore pUC19-SPYNE e LUH-pSPYCE plasmids. Nessun segnale fluorescente viene rilevato.

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Discussion

  1. Per gli utenti prima volta, si consiglia di praticare l'intera procedura, dalla preparazione delle cartucce di osservazione, con un singolo giornalista plasmide costitutivo come 35S:: GFP o 35S:: GUS. Abbiamo usato un 35S:: GFP plasmide ottenuto da Drs. Steve Monte e Xiaoning Zhang 6 (Figura 1A, D). Le cartucce colpo di controllo gene venduti a RioRad (Cat 165-2244) non sono adatti per le piante.
  2. Per BiFC, un secondo controllo positivo è necessario, che dovrebbe consistere in due partner noto che interagiscono fusa al C-terminale e N-terminale frammenti di YFP, rispettivamente.
  3. Per BiFC, è necessario includere diversi controlli negativi: (1) X proteina fusa al frammento N-terminale di YFP più un vettore che codifica per il frammento C-terminale, (2) Y proteina fusa al C-terminale del frammento YFP più un vettore che codifica per il frammento N-terminale, (3) solo vettore.
  4. Uno schermo di diffusione può essere utilizzata sulla base della Helios barile Gene Gun quando spara il colpo, che serve a ridurre i danni ai tessuti. Nel nostro studio, non abbiamo usato lo schermo diffusione.
  5. Durante la visione microscopica di YFP fluorescenza mediato da BiFC, tempo di esposizione alla luce di eccitazione deve essere ridotto al minimo per ridurre le foto sbiancamento.
  6. Cartucce conservati in fiale di scintillazione contenente materiale essicante sono buone per diversi mesi.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Ringraziamo Drs. Steve Monte e Xiaoning Zhang per il 35S:: GFP pGlowbug costruire e la Fellowship Hokensen dottorato di ricerca in laboratorio CH Z. L's è supportato dal US National Science Foundation (IOB0616096 e MCB0744752). ZL è parzialmente supportata dalla University of Maryland Stazione esperimento agricola.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yellow onion Any Supplier
Helios Gene Gun Bio-Rad
Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP Zeiss, Nikon, Olympus

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References

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Comments

1 Comment

  1. In my experience, red onions are better than yellow onions

    Reply
    Posted by: Betsy B.
    July 31, 2012 - 10:35 AM

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