Imágenes in vivo de los cultivos transgénicos parásitos Leishmania en un host en vivo

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Thalhofer, C. J., Graff, J. W., Love-Homan, L., Hickerson, S. M., Craft, N., Beverley, S. M., Wilson, M. E. In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host. J. Vis. Exp. (41), e1980, doi:10.3791/1980 (2010).

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Abstract

Distintas especies de

Protocol

1. La infección de animales pequeños con transgénicos Leishmania

1. Parásito líneas

Transgénicos Leishmania spp. parásitos que expresan luciferasa se ​​generan mediante una episomal o un vector de integración como se informó. 1 2 líneas clonales son las preferidas. Dos puntos importantes son:

(A) luciferasa integrado es preferible a la luciferasa episomal, ya que en teoría estas líneas parásito mejor debería mantener el transgén en la ausencia de medicamento para la presión, es decir, después de la introducción en un mamífero. Sin embargo, incluso los transgenes integrados se pueden perder en las tarifas bajas, 3 lo que es fundamental para mantener la presión selectiva de fármacos sobre la cultura de valores. En la práctica, Leishmania spp. a menudo conservan elementos episomal durante un período prolongado, incluso en vivo, aunque con variación en el número de copias del plásmido por célula. 4 Para cualquier tipo de parásito transgénicos, siempre se debe pasar un tiempo in vitro antes de la inoculación en animales para evitar posibles efectos de drogas.

(B) las especies de Leishmania. parásitos puede perder virulencia durante el cultivo in vitro. En algunas especies (por ejemplo, L. donovani, L. infantum chagasi), esta pérdida puede ocurrir rápidamente en las semanas de la cultura. En otras especies (por ejemplo, L. major, L. mexicana) virulencia se mantiene a largo plazo, por meses o años. Sin embargo, clonal transfectantes deben ser examinados para identificar a los virulencia de retención completa para los animales pequeños. Muchos laboratorios serie pasará a los parásitos en varias ocasiones (4 o más) a través de ratones o hámsters para aumentar la virulencia antes de su uso en los experimentos.

2. Preparación de los parásitos infecciosos metacíclicos etapa de la infección

La forma infecciosa de Leishmania spp. que se transmite por la mosca de la arena para el huésped mamífero es el promastigotes metacíclicos. 5 Por lo tanto, las infecciones de los animales con esta forma del parásito son preferidos como un modelo de infección natural. A pesar de las moscas de arena son difíciles de mantener, los parásitos cultivados in vitro convenientemente se someterá a metaciclogénesis. El porcentaje de metacíclicos presentes en un cultivo varía según el número de pases ya que el aislamiento de los animales, los medios de cultivo y la especie del parásito y la tensión.

Metacíclicos puede ser purificada por la selección positiva o negativa dependiendo de la especie y la línea de Leishmania. Los cambios en la terminal o lateral residuos de carbohidratos de cadena de la superficie abundante tases de (GLP) de L. importante permitir que sea purificado por la pérdida de aglutinación con la lectina PNA (aglutinina de maní). 5,6 Otras especies de Leishmania o L. mutantes que carecen de grandes metacíclicos GLP puede ser purificado en un gradiente de Ficoll paso 7. IVIS se puede realizar utilizando a granel sin purificar las culturas, pero hay que reconocer que estos contienen una mezcla de metacíclicos y formas menos infecciosas.

Por lo general, el 15-20% de volumen de fase estacionaria L. i. culturas chagasi se recuperan como metacíclicos la utilización de parásitos que han sido aislados a menos de 3 semanas a partir de un hámster o un ratón. Los parásitos se lavan por centrifugación, se suspendió a la concentración deseada en el buffer (HBSS o PBS, con o sin Ca 2 + y Mg 2 +), y se mantiene a 4 ° C durante hasta 2 horas antes de la inoculación en el ratón.

3. Elección de la vía para la inoculación de Leishmania spp. en el huésped

Las manifestaciones de la enfermedad clínica de la leishmaniasis humana varían en función tanto de la especie del parásito y los factores del huésped. Hay diferencias correspondientes en la infección murino, los investigadores que llevan al uso de diferentes modelos y vías de infección. Por ejemplo, las especies que causan CL humanos (por ejemplo, L. major, L. mexicana, L. amazonensis) a menudo son inoculadas en ratones por vía subcutánea en la pata o por vía intradérmica en el oído. 8,9 especies causantes de la LV humana a menudo se introduce por vía intravenosa a través de una cola 10-12 vena o por vía intradérmica en el oído. 13 infecciones vena de la cola se han realizado, ya sea con hámster derivado amastigotes o promastigotes. En forma rutinaria infectar a los ratones con la forma de promastigotes de L. i. chagasi, ya sea por vía intradérmica en el oído o la región lateral del tarso 14 o por vía intravenosa.

4. Pre-tratamiento de ratones con anestesia

Ratones de tipo salvaje, transgénicos o el gen se puede utilizar. Aunque no formalmente, cuantificado, lo más probable es que desnuda o albino como ratones Balb / c permite una mayor transmisión de luz a través del tejido en comparación con los ratones de piel oscura y el pigmento del cabello, tales como C57BL / 6.

Inyectables agentes anestésico como una mezcla de ketamina más xilacina [80-100 mg / kg + 10 mg / kg, respectivamente, intraperitoneally (ip)] diluida en solución salina es un método preferido, ya que los animales serán ligeramente anestesiado durante al menos 10 minutos con una sola dosis. 100-200ul volumen total se inyecta ip utilizando una aguja de calibre 25-30. Los animales están restringidos de forma manual con firmeza por su piel dorsal con el abdomen y la cabeza hacia abajo. La aguja debe colocarse con el bisel hacia arriba y ligeramente inclinada. La punta de la aguja sólo deben penetrar un poco en el cuadrante inferior izquierdo de la pared abdominal.

Inhalantes como isoflurano anestesia alternativamente se puede utilizar, pero los animales sólo se mantendrá bajo anestesia durante tanto tiempo como son la inhalación del agente anestésico.

5. La infección de ratones con Leishmania spp. parásitos

Una vez que los animales estén ligeramente anestesiado, los sitios de infección se limpian con un 70% de alcohol etílico o isopropílico. La ruta de especies de parásitos, la dosis y la infección está determinado por el investigador. El volumen de inyección debe ser minimizado para prevenir el daño tisular excesiva para las inyecciones intradérmicas (10 l) o intramuscular (25-50 l) Las rutas de infección. Los volúmenes de inyección permitido en los ratones puede ser mayor por vía intravenosa (100-200 l), subcutánea (hasta 2 ml) o intraperitoneal (hasta 2 ml) rutas de infección.

Vías de infección y los volúmenes utilizados en nuestros experimentos incluyen intradérmica en el pabellón auricular del oído (10 l), por vía subcutánea en el flanco (100-200 l), intraperitoneal (100-200 l) o intravenosa (100-200 l). Dosis de parásitos han variado desde 02 10 hasta julio 10 promastigotes.

2. Bioluminiscente de imágenes de Leishmania con el IVIS (en vivo sistema de imágenes)

1. Preparación de D-luciferina en vivo bioluminiscente de imágenes

D-luciferina (Caliper LifeSciences) se reconstituye a una concentración de 15 mg / ml en PBS de Dulbecco, con o sin Mg 2 + y Ca 2 +, y una jeringa filtrada (0,2 mm). Alícuotas se congelan a -80 ° C hasta su uso. Antes de la inyección, la luciferina se calienta a 37 ° C en un baño de agua.

2. La inyección de D-luciferina

El sitio de la inyección se limpia y luciferina se introduce en los animales sensibles con una inyección intraperitoneal de 15 mg / ml de solución de luciferina en DPBS, a una dosis de 150 mg / kg. Luciferina también puede ser inyectado en los animales tratados con anestesia, pero la cinética de la bioluminiscencia puede variar ligeramente.

Una vez inyectadas en animales, la luciferina circula rápidamente. Es útil para determinar empíricamente el momento óptimo para la adquisición de datos luminiscentes después de la inyección luciferina para cada modelo experimental y para diferentes localizaciones anatómicas de los ratones, ya que la cinética de la distribución de la luciferina puede variar. Una curva de cinética generada por la adquisición de una secuencia de imágenes replicar.

3. Los animales son anestesiados ligeramente

Anestésicos por inhalación o inyección puede ser utilizado para el procedimiento de imagen. El isoflurano es más fácil de administrar en esta etapa, ya que la mayoría de los sistemas IVIS con una cámara adjunta anestesia y la nariz anestesia múltiples cono interior de la cámara de imágenes. La anestesia se divide entre la cámara de anestesia y el colector interior de la cámara de imágenes.

Los animales se colocan en la cámara de plexiglás anestesia claro y ligeramente anestesiados con isoflurano 2,5 a 3,5%. Los animales son visualmente monitoreados para asegurar un grado efectivo de la anestesia ha sido inducido, y que su respiración es sin obstáculos. Grado suficiente de la anestesia se verifica por la falta de retirada de presión en la pata dolorosa. La cantidad de isoflurano puede ser reducido a 1,5 a 2% de los animales son anestesiados ligeramente.

4. Bioluminiscentes se recogen los datos

Animales anestesiados adecuadamente se transfieren de la cámara de anestesia a la cámara de imágenes y de modo que los conos de nariz conectada al colector entregará un flujo continuo y regular de isoflurano.

La viva imagen del programa de software (Caliper Life Sciences) se abre y el IVIS inicializa. Para nuestros experimentos, se utiliza el sistema de Xenogen IVIS 200 (Caliper Life Sciences). La cámara CCD automáticamente se enfría y se mantiene a la temperatura adecuada después de inicializar el IVIS. La configuración del sistema de la cámara y los parámetros de adquisición de imágenes se fijan en el panel de control del sistema IVIS. Los parámetros de adquisición se basan principalmente en el número de animales y la intensidad de la bioluminiscencia. Los parámetros más importantes son: modo de imagen (luminiscentes o fluorescentes), el tiempo de exposición (el tiempo que el obturador está abierto), hurgar en la basura (que determina el tamaño en píxeles del CCD), el enfoque y la altura del objeto (plano focal), f / stop (tamaño de apertura) y campo de visión (FOV). El campo de visión preestablecidoss (regiones cuadradas imagen) para el IVIS Imaging System de la serie 200 son de 4, 6,5, 13, 20 y 25 cm (ancho del campo de visión).

Al pulsar adquirir o adquieran fotos continuas en la ventana de control del sistema IVIS inicia la imagen y adquisición de datos en el IVIS. Tiempos de adquisición puede variar desde unos segundos hasta varios minutos. Para nuestros experimentos, utilizamos los 60 segundos de exposición configuración por defecto.

Una imagen de primer plano (pequeño campo de visión) puede proporcionar una mayor resolución, pero no necesariamente una mayor sensibilidad en comparación con una imagen tomada con un campo de visión más amplio.

Después de que el procedimiento de imágenes, los animales son retirados de la cámara de imágenes, devueltos a sus jaulas y monitorear hasta que se recupere de la anestesia.

7. Análisis de los datos

Los datos de luminiscencia se analizaron mediante el programa de imagen de vida (Xenogen) y corresponde a la intensidad de la luz expresa como el número de fotones detectados por la cámara CCD. Estos datos están representados por una imagen pseudo-color que se superpone sobre una fotografía en blanco y negro de los animales. Las áreas específicas de la imagen se puede analizar mediante la creación de regiones de interés (ROI). El software de imagen viva proporciona una variedad de opciones de salida de datos. Una de las formas más sencillas para analizar los datos es la selección de una región de interés (ROI) y calcular la media de los fotones # / segundo que se detecta. Estos datos pueden ser exportados a una hoja de cálculo, como Microsoft Office Excel (Microsoft Corporation). GraphPad Prism (GraphPad Software) se utilizó posteriormente para generar gráficos de este manuscrito.

3. Resultados representante

Resumen:

IVIS tecnología permite la visualización de la luciferasa que expresan spp Leishmania. parásitos que viven anestesiados ratones Balb / c en tiempo real. Una vez que el sustrato luciferina distribuye a través de los tejidos, la rápida oxidación de D-luciferina por la luciferasa expresadas por los parásitos transgénicos hace que la luz se emite. Los fotones que no son absorbidos por el tejido se detectan en la superficie del animal por la cámara CCD de la tecnología de imagen IVIS.

1. Modelos de infección con parásitos causantes de la leishmaniasis visceral humana cutánea frente a humanos.

Los modelos murinos de la leishmaniasis visceral son más problemáticos que los modelos de la leishmaniasis cutánea, ya que el progreso de la infección requiere la eutanasia de los grupos de ratones en cada momento de evaluación. Una limitación de IVIS es que las emisiones de luz se apaga en diferentes grados en diferentes tejidos viscerales, y los tejidos con alto flujo de sangre, como el hígado y el bazo pueden ser más problemáticos que la piel. Por lo tanto, IVIS pueden no ser tan sensible para la detección de la luciferasa que expresan los parásitos en el hígado y el bazo como en la piel. También se aconseja que la carga de parásitos no se deben comparar entre los sitios de tejido. Sin embargo, la carga de parásitos en los mismos tejidos pueden ser comparados entre emparejados por edad ratones infectados de la misma cepa.

La señal de luciferasa se detecta fácilmente en los órganos viscerales en nuestros experimentos, lo que facilita la comparación de las infecciones entre los animales. Un ejemplo de una infección de 5 semanas con un parásito que causa la luciferasa que expresan la leishmaniasis visceral humana, Li. chagasi SSU/IR1SAT-LUC (A), se muestra en la Figura 1. Después de 5 semanas de la infección, parásitos visceralized pueden ser detectados en los hígados de los ratones y en el bazo de los ratones 1 y 2. La figura 2 muestra un ajuste de la dosis con la línea de parásito mismo, una hora después de la introducción del parásito. Un ejemplo de una infección longitudinal con parásitos que causan la leishmaniasis cutánea humana, L. mexicana SSU/IR1SAT-LUC (A), se muestra en la Figura 3.

2. Cinética de la detección de la luciferasa.

Preliminar de los estudios cinéticos son esenciales para maximizar la detección de fotones emitidos por los parásitos bioluminiscentes. Es importante determinar esto empíricamente, ya que la imagen en tiempo óptimo es probable que varíe dependiendo de la cantidad y el brillo del parásito aislar y de la localización anatómica de los microorganismos luminiscentes en los ratones. Los estudios de cinética dependen de la tasa de distribución de luciferina largo de los tejidos, los tejidos de ratón que expresan luciferasa albergar Leishmania, y la eficiencia de la luciferasa de la expresión / actividad de la enzima en cada parásito aislar. Los ratones están infectados y se inocula con luciferina como se describió anteriormente, y una secuencia de imágenes se capturan cada dos minutos después de la inyección luciferina. La magnitud de la luz emitida se cuantifica y grafica para determinar el punto máximo de detección (ver ejemplo en la Figura 1B). Una vez que el tiempo de detección de luz máxima es determinada, todas las imágenes en el experimento debe utilizar el mismo tiempo de la imagen después de la inoculación de la luciferina, como en la figura 1A. Nuestros estudios cinéticosdemostrado una señal de luciferasa pico del hígado de los ratones infectados con L. iv i. chagasi entre 10 y 25 minutos después de la inoculación ip luciferin (fig. 1B).

3. Evaluar la eficacia de la inoculación del parásito.

IVIS pueden ser utilizados para estimar la coherencia y eficiencia de la infección inicial con luciferasa que expresan Leishmania spp. Siempre y cuando la ruta se utiliza el mismo para cada animal, los fotones emitidos se puede utilizar como una estimación aproximada de la eficacia de la inoculación. Un ejemplo se muestra en la Figura 2, en el que ratones Balb / c fueron inoculados con el número indicado de metacíclicos L. i. chagasi promastigotes, una especie de Leishmania visceralizing. Una hora después de la infección los ratones fueron inoculados con ip luciferina, y después de 20 minutos las imágenes fueron tomadas. La figura muestra la imagen en blanco y negro solo (Figura 2A) y la imagen superpuesta con pseudo-color luminiscencia (Figura 2B). La Figura 2c muestra el número de fotones emitidos por las regiones escogidas de interés (ROI) de las imágenes del ratón.

El ejemplo de la figura 2 se muestra que la dosis de infección es directamente proporcional a la gradación de los fotones emitidos con un creciente número de parásitos. Los datos muestran que, al igual que L. major y L. mexicana, imágenes de las infecciones cutáneas con Leishmania spp. es muy sensible, lo que permite menos de 10 4 parásitos que se visualiza claramente. Datos como estos pueden ser utilizados para cuantificar la intensidad de la infección. En el ejemplo que se muestra en la Figura 2B, hay aproximadamente una fotones / s / parásito.

4. Seguimiento de la evolución de la infección en los ratones.

Los modelos murinos de la leishmaniasis cutánea característica el uso tamaño de la lesión como una medida para dar pie a infecciones longitudinalmente. A pesar de una buena estimación de la progresión de la enfermedad, tamaño de la lesión se ve afectada por el grado de respuesta inflamatoria, además de la tasa de replicación del parásito en los tejidos. Los ratones deben ser sacrificados al final del experimento para medir realmente la carga parasitaria. IVIS pueden ser utilizados para estimar la progresión de la carga de parásitos de forma longitudinal en el tejido cutáneo de ratones infectados con especies de Leishmania que causan la leishmaniasis cutánea. Muestra en la Figura 3, ratones Balb / c fueron inoculados por vía subcutánea en el día 0 con 10 5 L. mexicana que expresa la luciferasa y la imagen de la semana después de la infección secuencial. La figura 3A muestra imágenes representativas de 10-31 semanas después de la infección. Los mismos datos se muestran en forma cuantitativa, en la Figura 3B. Es importante destacar que el número de parásitos en el sitio de la infección pueden ser cuantificados por IVIS antes de una lesión es detectable por otros métodos.

Con el tiempo, el aumento progresivo de la bioluminiscencia corresponde a un aumento en el número de parásitos. La intensidad de la señal, es decir, los fotones / parásito / segundo, puede variar en función del número de parásitos, la localización del tejido, la fase de crecimiento y la salud del parásito in vivo. Por eso es importante para calibrar la relación entre los parásitos y la luminiscencia antes de asumir que la bioluminiscencia es directamente proporcional al número de parásitos. En el caso de L. los principales 15 o L. Mexicana, 16 no parece haber una atenuación relativamente poco de la bioluminiscencia en amastigotes dentro de las lesiones en relación con la almohadilla plantar promastigotes. Los datos preliminares sugieren que la atenuación puede ser más profunda de L. chagasi infantum 17 o de L. braziliensis 15.

Figura 1
Figura 1. Cinética de la detección de la luciferasa. El análisis cinético de la distribución de la luciferina se realizó para establecer el momento óptimo para obtener imágenes de la infección por Leishmania en el hígado. Los ratones fueron infectados iv con 10 7 L. i. chagasi pIR1SAT-LUC (A). A) Cuatro ratones infectados fueron fotografiadas junto con un ratón infectado después de 5 semanas de la infección. Luciferina se inyectó ip en los cinco ratones y las imágenes se recogieron cada dos minutos durante 24 minutos. Retorno de la inversión fueron seleccionados y luminiscencia fue medido y cuantificado (B).

Figura 2
Figura 2. Evaluar la eficacia de la inoculación del parásito. Imágenes bioluminiscentes y cuantificar los parásitos Leishmania durante la infección con IVIS. De tipo salvaje ratones Balb / c fueron inyectados por vía intradérmica en el flanco inferior derecha con HBSS (falso) o transgénicos Leishmania i. L. chagasi i. chagasi pIR1SAT-LUC (A). Los ratones fueron analizados con la tecnología de imagen IVIS una hora después de la inoculación. A) Una fotografía en blanco y negro de los ratones fue tomada inmediatamente antes de la señal luminosa (intensidad de la luz) se midió. Las flechas rojas señalan el lugar de la inyección en cadaanimal. B) La imagen de pseudo-color de la luminiscencia se superponen sobre la fotografía. C) Las regiones de interés (ROI) fueron seleccionados (círculos rojos) y la luminiscencia se cuantificó en cada retorno de la inversión. Los datos representan la luminiscencia de retorno de la inversión neta de infectados, menos el retorno de la inversión de los simulacros de infectados.

Figura 3
Figura 3. Infección a largo plazo con un parásito que causa la leishmaniasis cutánea humana. Evolución temporal de la evaluación de la carga parasitaria en un solo animal inyectado con bioluminiscentes Leishmania mexicana pIR1SAT-LUC (A). Un tipo salvaje ratón BALB / c se inyecta por vía subcutánea en el corvejón con 100.000 fase estacionaria transgénicos Leishmania mexicana pIR1SAT-LUC (A). IVIS datos fueron recogidos de los ratones infectados en el número indicado de semana post-infección. A) Pseudo-color imágenes de la luminiscencia se superponen a imágenes en blanco y negro de los puntos de tiempo correspondiente. B) El retorno de la inversión neta se determinó mediante la medición de la luminiscencia en el corvejón infectados y restando retorno de la inversión de fondo de la punta del corvejón no infectados contralateral fue graficada. El gráfico de dispersión representa retorno de la inversión neta en diversos puntos temporales después de la infección.

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Discussion

El sistema de imágenes in vivo (IVIS) proporciona un método para obtener imágenes de animales enteros o en vivo modelos de infección experimental de imágenes de diferentes formas de leishmaniasis. 18,16 La spp Leishmania. los parásitos pueden ser modificados para expresar la luciferasa de luciérnaga en un nivel que se detecta en vivo con la tecnología de imagen IVIS. Una de las principales ventajas de este método es que permite la visualización no invasiva de Leishmania spp. dentro del huésped animal vivo. Este método se ha aplicado a otros modelos de enfermedades infecciosas, el uso de agentes infecciosos que pueden expresar transgenes. 19 20 Por otra parte, IVIS ha sido utilizado como un modelo para evaluar la terapia farmacológica de la infección por Leishmania major en la piel de ratones C57BL / 6. 16,21

Hay algunas advertencias y limitaciones importantes de este método. La fuerza de la señal de luz detectada por la cámara CCD puede verse afectada por la ubicación de los parásitos en el huésped mamífero, por la fuerza de la expresión de luciferasa en los parásitos, por la disponibilidad de cofactores para la reacción de oxidación de D-luciferina y por la absorción de luz por los tejidos que recubre. Además, la intensidad de la señal en el hígado y el bazo es más débil en el nivel de fotones por parásitos por segundo que la señal en la piel, probablemente debido a la extinción por la oferta local de la sangre y los tejidos que recubren. La cuantificación de los fotones emitidos se pueden utilizar para comparar la infección progresiva en un solo animal a través del tiempo, o en el mismo tejido entre los animales. 16 Sin embargo, hasta optimizar aún más, estas advertencias se limitará la sensibilidad y por lo tanto la utilidad del método para la evaluación cuantitativa de infecciones profundas con la visceralizing spp Leishmania. Finalmente, las imágenes tienden a ser más débiles en negro (por ejemplo, C57BL / 6) los ratones que en los blancos (por ejemplo, BALB / c) de los ratones. Afeitarse la piel el pelo que cubre el área de interés puede ser útil en la detección de la señal de los ratones negro.

Otras consideraciones son la necesidad de validar el IVIS como una medida cuantitativa de la carga de parásitos. Las comparaciones entre la microscopía, qPCR y IVIS se han hecho en unos pocos casos, pero serían necesarios en cada sistema para validar el uso del método como una medida de la progresión de la enfermedad. 22 16 Los nuevos métodos de imagen son emergentes, lo que puede ser acoplado a imágenes de bioluminiscencia. 16 Además de los parásitos transgénicos, los huéspedes animales pueden ser manipuladas para expresar moléculas luminiscentes o fluorescentes. Futuros estudios con esta técnica podría incluir los animales que expresan transgenes en determinados compartimentos celulares para detectar los factores del huésped implicados en la patogénesis y parásitos simultáneamente.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado en parte por una subvención de revisión al Mérito del Departamento de Asuntos de Veteranos, por las subvenciones del NIH AI045540, AI067874, AI076233-01 y AI080801 (MEW), y por AI29646 (SMB). El trabajo fue realizado en parte en la financiación de la TC y la JG por el NIH T32 AI07511.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
D-Luciferin Potassium Salt Reagent Caliper Life Sciences 122796
IVIS Imaging System 200 Series Equipment Caliper Life Sciences Other IVIS models that can be used include: Lumina II, Lumina XR, Kinetic, and Spectrum.

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  1. thank you.i,am lecturer in vet.college.i wants any formation about vet. parasitology ,also books. please.

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    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 11:55 AM
  2. thank you.i,am lecturer in vet.college.i wants any formation about vet. parasitology ,also books. please.

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    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 11:55 AM
  3. thank you.i,am lecturer in vet.college.i wants any formation about vet. parasitology ,also books. please.

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    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 11:55 AM

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