T-wave Ion Mobility-massaspectrometrie: Basic Experimentele Procedures voor Protein Complex Analysis

Biology
 

Summary

Ion mobility-massaspectrometrie is een nieuwe gas-fase ionen technologie die scheidt, op basis van hun botsing doorsnede en massa. De methode biedt drie-dimensionale informatie over de algemene topologie en de vorm van eiwitcomplexen. Hier schetsen we een basisprocedure voor het instrument instellen en optimaliseren, kalibratie van drift tijden en data interpretatie.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Michaelevski, I., Kirshenbaum, N., Sharon, M. T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis. J. Vis. Exp. (41), e1985, doi:10.3791/1985 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ion mobiliteit (IM) is een methode die de tijd genomen voor een ion te reizen door middel van een druk cel onder invloed van een zwak elektrisch veld maatregelen. De snelheid waarmee de ionen doorkruisen de drift regio is afhankelijk van hun grootte: grote ionen een groter aantal botsingen ervaring met de achtergrond inert gas (meestal N 2) en dus reizen meer langzaam door de IM-apparaat dan de ionen die een kleinere vormen doorsnede. In het algemeen, de tijd die het duurt voor de ionen om te migreren hoewel de dichte gasfase scheidt hen, volgens hun botsing doorsnede (Ω).

Onlangs werd IM spectrometrie gekoppeld aan massa spectrometrie en een reizende-wave (T-golf) Synapt ionen mobiliteit massaspectrometer (IM-MS) werd uitgebracht. Het integreren van massaspectrometrie met ion mobiliteit in staat stelt een extra dimensie van het monster scheiding en definitie, waardoor een drie-dimensionale spectrum (massa op te laden, de intensiteit en drift tijd). Deze scheiding techniek kan de spectrale overlap te verminderen, en maakt resolutie van heterogene complexen met zeer vergelijkbare massa, of massa-tot-lading ratio's, maar verschillende drift tijden. Bovendien is de drift tijd metingen geven een belangrijke laag van structurele informatie, zoals Ω is gerelateerd aan de totale vorm en topologie van het ion. De correlatie tussen de gemeten drift tijd waarden en Ω wordt berekend met behulp van een kalibratie-curve gegenereerd uit kalibratieoplossing eiwitten met gedefinieerde doorsneden 1.

De kracht van de IM-MS aanpak ligt in zijn vermogen om het subunit verpakking en algemene vorm van de verzamelingen van eiwitten bij micromolaire concentraties te definiëren, en bijna-fysiologische omstandigheden 1. Verschillende recente studies IM van zowel individuele eiwitten 2,3 en niet-covalente eiwitcomplexen 4-9, met succes aangetoond dat eiwit quaternaire structuur behouden blijft in de gasfase, en benadrukt het potentieel van deze benadering in de studie van de verzamelingen van eiwitten van onbekende geometrie . Hier bieden wij een gedetailleerde beschrijving van de IMS-MS analyse van eiwitcomplexen met behulp van de Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd, de enige commerciële IM-MS instrument op dit moment beschikbaar) 10. Beschrijven we de basis optimalisatie stappen, de kalibratie van de botsing doorsneden, en methoden voor gegevensverwerking en interpretatie. De laatste stap van het protocol bespreekt methodes voor de berekening van de theoretische Ω waarden. Het geheel genomen, is het protocol geen poging om elk aspect van IM-MS karakterisering van verzamelingen van eiwitten te dekken, maar veeleer, haar doel is om de praktische aspecten van de methode te introduceren om nieuwe onderzoekers in het veld.

Protocol

De procedure die wij beschrijven richt zich uitsluitend op IM-MS analyse van eiwitcomplexen. Daarom stellen we voor dat de onderzoekers onbekend met het gebied van structurele MS verwijzen naar de monstervoorbereiding stappen, kalibratie en MS en tandem MS optimalisatie procedures beschreven in Kirshenbaum et al.. Http://www.jove.com/index/details 2009. stp? ID = 1954. In het algemeen is dit protocol gaat om lage micromolaire concentraties van complexe (1-20 uM) in een vluchtige buffer zoals ammonium acetaat (0,005 - 1 M, pH 6-8). Omdat die bij 1-2 ul worden verbruikt per nanoflow capillaire, raden we aan 10 tot 20 pl als een minimaal volume, tot optimalisatie van MS omstandigheden mogelijk te maken.

Deel 1: Het verwerven van een ion mobiliteit-massaspectrometrie spectrum

  1. Zet de massa spectrometer op de volgende werkingsmodi: Mobility-TOF, positieve ion acquisitie, en de V-mode.
  2. Zet alle gassen (API, Trap en IMS). We maken gebruik van N 2 voor IM scheiding, en Ar voor de Trap / Transfer. Aanbevolen initiële waarden zijn 1,5 ml / min voor de Trap regio en een gasstroom van 24 ml / min voor de IMS-apparaat.
  3. Zet de m / z acquisitie bereik. Voor een onbekend eiwit complex, we raden het eerste gebruik van een breed scala massa, die vervolgens kunnen worden teruggebracht tot de gewenste waarden. Parallel, past u de MS profiel voor maximale transmissie-efficiëntie. Voor grote complexen, moeten de overname massabereik worden ingesteld van 1.000 - 32.000 m / z, en de MS profiel op Auto. Anders kan het profiel worden ingesteld, volgens de volgende tabel:
    m / z wonen (%) helling (%)
    960 10 20
    3200 30 40
    10667
  4. Controleer de RF-instelling en, indien nodig, aan te passen aan waarden die geschikt zijn voor grote eiwitcomplexen, dus:
    Bron Val IMS Overdracht
    RF Offset 450 380 380 380
    RF-Gain 0 0 0 0
    RF-Limit 450 380 380 380
  5. Van toepassing zijn capillaire spanning (1,050-1,400 V) en een lage nanoflow druk (0.00-+0.03 bar). Zodra spray is gestart, proberen om de druk te verminderen nanoflow tot een minimale waarde. Daarnaast is de positie van de capillaire, met betrekking tot de kegel.
  6. Pas de MS-acquisitie parameters, een goed opgelost MS spectrum te verwerven: de drukgradiënt over het instrument en de sampling cone en de extractie kegel, moet bias, Trap en de overdracht mogelijke instellingen, allen geoptimaliseerd worden (die in het begeleidend Jove protocol Kirshenbaum et al.. http://www.jove.com/index/details.stp?ID=1954 2009). Hoewel deze parameters zijn sample-afhankelijke, de voorwaarden die we gebruiken voor het verwerven van MS-spectra van verschillende ion massa's, van peptide om eiwitcomplexen, staan ​​beschreven in tabel 1, (zie ook Fig. 1). Aan de activering van het complex proberen te minimaliseren geleidelijk te verminderen (in stappen van ~ 10 V) het monster kegel, Trap en bias spanningen zonder de positie van de piek.
  7. Zodra een optimale massaspectrum wordt verkregen van de drift tijd profiel moet worden aangepast. Bij het analyseren van verzamelingen van eiwitten, optimale condities voor zowel de massa en mobiliteit metingen zijn vaak onverenigbaar, daarom is het belangrijk om de juiste balans te vinden tussen de twee. In het algemeen moet de ionen mobiliteit plot worden geoptimaliseerd zodanig dat de pieken zijn verdeeld over het hele drift tijd bereik, en de piek profiel is glad, het naderen van een Gaussische verdeling (Fig. 2A, 2B). Significante piek asymmetrie kan worden gerelateerd aan een slechte scheiding van meerdere conformaties.
  8. Als algemene regel geldt, kunnen drie parameters, T-wave velocity, T-golfhoogte en IMS gasdebiet worden afgestemd op de mobiliteit scheiding te optimaliseren. Het verhogen van de T-golf snelheid zal verruiming van de drift tijd Distribution Profile, terwijl de verhoogde T-golfhoogte waarden smal is. Evenzo zal de drift tijdprofiel het verhogen van de IMS-gasstroom verschuiving naar hogere waarden (de minimale IMS gasstroom moet 10 ml / min zijn). Wij stellen voor het verlaten van twee van de drie vaste beschikbare variabelen, en het optimaliseren van de derde tot aan de IM-spectrum is goed opgelost (Fig. 2B). Te dien einde, stelt u de T-golf snelheid en de gasstroom tot 250 m / s en 24 ml / min, respectively. Dan, als uitgangspunt, stelt u de T-golfhoogte tot 3 V, en in een stapsgewijze manier, te verhogen in een V stappen. In het algemeen zal een grotere ionen een hogere golfhoogten. Meestal is er geen noodzaak om de IMS-pressure aan te passen; echter, wanneer hoge bias spanningen nodig zijn om te stemmen, het verminderen van de IMS gas zal een daling van de bias voltage waarde en, bijgevolg, een vermindering van de eiwitcomplex activering mogelijk te maken. Al met al kan maximale resolutie van 10-12 t / At worden bereikt.
  9. Als de omstandigheden niet optimaal (lage T-golfhoogte of hoge T-wave velocity en / of hoge druk IM), zal de ionen niet effectief doorkruisen via de IM-apparaat, en hun reis kan langer duren dan de tijd die nodig is voor de volgende ion packet vrijgelaten worden in de mobiliteit cel. Als gevolg hiervan zal een nieuwe ion pakket worden vrijgesteld van de Trap regio voor het vorige pakket is afgeleverd bij de duwboot regio. Dit zal leiden tot een 'roll-over' effect, waarbij de piek waargenomen in het eerste deel van de drift tijd spectrum is identiek aan die van de ionen in de staart rand (fig. 2C). Dit artefact kan worden geëlimineerd door het verhogen van de T-golfhoogte, en het verminderen van de T-golf snelheid en IMS druk. Daarnaast kan de Trap release tijd worden aangepast. Bovendien is het belangrijk om te valideren dat de overdracht T-golfhoogte is ingesteld op ten minste 5 V. Om lekkage van ionen naar de IMS cel te voorkomen, adviseren wij dat de mobiliteit val hoogte worden gehouden bij maximale niveaus (30 V).
  10. Lage snelheid en hoge amplitude van Transfer T-golven kan leiden tot de "kabbelende" van de drift tijd distributie profiel (fig. 2D). Dit artefact treedt op wanneer de mobiliteit scheiding van ionen (ionen aankomst / drift tijd) wordt niet onderhouden door de Transfer en ToF regio's, als gevolg van een gedeeltelijke synchronisatie tussen de pusher frequentie en de overdracht van T-wave velocity. Om dit effect te elimineren, ofwel de duwboot tijd of de Transfer T-golf snelheid worden aangepast. Omdat de pusher frequentie is gerelateerd aan de massa bereik, kan dit artefact opnieuw worden weergegeven wanneer deze parameter is veranderd. T-golfhoogte oefent een gering effect, hoewel de vermindering kan ook helpen om rimpels te elimineren.
  11. Zodra de bovengenoemde parameters worden geoptimaliseerd, kan de IM-MS data worden verworven.

Deel 2: Screening experimentele condities om de mobiliteit metingen van inheemse structuren zorgen

Tot zeer opgelost MS toppen te bereiken, worden eiwit-complexen vaak geactiveerd in de massa spectrometer, aan het strippen van het resterende water en buffer componenten 11 te bevorderen. Echter, als de activatie-energie verhoogd tot meer dan een drempelwaarde, kan een gedeeltelijke ontvouwing worden opgewekt de vorming van meerdere tussenliggende staten 12, die waarschijnlijk niet overeen te komen met de inheemse, oplossing-staatsstructuur (Fig. 3A-C). Als gevolg hiervan kan de drift tijd piek worden verschoven en verbreed, als gevolg van de heterogene bevolking van ontvouwde structuren.
Voor het verkrijgen van drift time data in overeenstemming is met oplossing-fase-structuren, is het essentieel om zorgvuldig de controle van de voltages wordt gebruikt voor het versnellen van ionen, voorafgaand aan de IM-scheiding. Bovendien, voor hoge resolutie MS verdient het de voorkeur het verhogen van de overdracht plaats van de Trap spanning. Omdat de IM-apparaat is geplaatst, eerst, gevolgd door de Transfer regio en de TOF analyzer, vandaar, de activering volgt de IM-meting en de ionen blijft onaangetast, terwijl de MS nauwkeurigheid kan worden verhoogd.

Om te valideren dat data-acquisitie wordt uitgevoerd onder omstandigheden die de oorspronkelijke structuur van het complex te behouden, is het aanbevolen dat de gegevens worden vastgelegd over een bereik van experimentele en oplossing voorwaarden, in plaats van volgens een enkele, geoptimaliseerde set van parameters:

  1. Verhoging van capillaire en kegel spanningen in een stapsgewijze manier, terwijl het toezicht op het effect op de drift tijd spectrum.
  2. Als in stap 1, verhoging van de Trap botsing spanning in een stapsgewijze manier, en het verwerven van gegevens bij 10 V intervallen.
  3. Het identificeren van de ontvouwde conformaties en beoordelen van de verkregen gegevens, met de hand te induceren dissociatie van het eiwitcomplex door titratie van het monster met azijnzuur op een pH van 2-7, en noteer de data (Fig. 3B).

Deel 3: correlatie tussen drift tijd waarden en doorsneden

In tegenstelling tot conventionele IM-metingen, waarbij de gemeten drift tijdwaarden lineair zijn gerelateerd aan Ω, in de T-golf IMS-systeem, is de doorsnede gedefinieerd door een kalibratie-aanpak. Dus, in plaats van een absolute meting, is een relatieve exponentiële correlatie ontstaat tussen de gemeten drift tijden en Ω 1,13: Vergelijking 1

waarbij t D is de gemeten drift tijd, en X is het aandeel constante die kan worden gewonnen uit een kalibratie-curve. De kalibratie is uit te voerened door het meten van de drift tijden van ionen met bekende Ω (gemeten van de traditionele IM experimenten).

  1. Drift tijdmetingen worden gekalibreerd met behulp van gedenatureerde eiwitten paarden cytochroom C, paard hart myoglobine en runderen ubiquitine met bekende botsing doorsneden. Te dien einde, oplossingen van 10 uM in 49/49/2, volume-verhouding, moet water / methanol / azijnzuur worden voorbereid (gebruikte reagentia staan ​​beschreven in tabel 3).
  2. Acquire IM-MS gegevens voor de kalibratieoplossing eiwitten onder precies dezelfde voorwaarden instrument gebruikt voor het doelwit eiwit of eiwit-complex: Vergelijking 7 (Deel 1). Alle spanningen en druk waarden moeten worden identiek aan de IM-scheiding instellingen te behouden.
  3. Voor elke laadtoestand van de kalibratieoplossing eiwitten extract van de experimentele drift tijdswaarde (t D) (beschreven in deel 4).
  4. Correcte elk van de kalibratieoplossing drift tijden (t D) (tabel 2) met behulp van de volgende vergelijking: Vergelijking 2 , Waar de m / z is de massa-tot-lading-verhouding van de waargenomen ion, en c is de Enhanced Duty Cycle (EDC) vertraging coëfficiënt 1. De waarde ervan, meestal tussen 1.4 en 1.6, is het instrument-afhankelijk. Het EDC-waarde wordt aangegeven binnen het Systeem | Overname Settings | Overname tabblad Setup.
  5. Met behulp van prof. David clemmer's Cross-Sectie Database:
    http://www.indiana.edu/ ~ clemmer / Onderzoek / cross% 20section% 20database/Proteins/protein_cs.htm 14 correct elk van de kalibratieoplossing cross-sectie voor zowel ion laadtoestand en de gereduceerde massa. Vergelijking 3
    , Waarbij Ω C is de gecorrigeerde doorsnede, Ω is de literatuur doorsnede, z is de ionenlading staat, m is het molecuulgewicht van de kalibratieoplossing ion, en M G is het molecuulgewicht van de IM-achtergrond gas (meestal N 2).
  6. In plot (t D) tegen In (Ω C) (Fig. 4A).
  7. De resulterende curve komt overeen met de volgende vergelijking: Vergelijking 4 De parameters X en A kan worden gewonnen door het aanbrengen van het complot om een lineair verband. De helling X komt overeen met de exponentiële verhouding factor en A staat voor de fit-bepaald constant.
  8. Bereken de pasvorm correlatiecoëfficiënt r 2, met behulp van de Pearson's vergelijking: Vergelijking 5 . Acceptabele waarden voor r 2 groter zijn dan 0,95 (Fig. 4B). Een lagere correlatiecoëfficiënt waarde kan te wijten zijn aan:
    1. Onvolledige ontvouwen van het eiwit kalibranten. Dit zal leiden tot piek verbreding als gevolg van de heterogene samenstelling van tussenliggende staten.
    2. In onze ervaring, kan een oude sample verslechteren van de IM-spectra.
    3. Ongelijke experimentele omstandigheden worden gebruikt voor de verschillende kalibrant eiwitten. In dit geval, het plotten van de gegevens voor elk eiwit afzonderlijk zou moeten genereren divers correlatiecoëfficiënten, hoewel elk van hen moet hoger zijn dan 0,95.
    4. Noisy gegevens en onjuist glad en centrering van de drift tijd distributie.
    5. Rekenfout.
  9. Recorrect de kalibrant drift tijd in met de vastgestelde exponentiële factor, X, afgeleid in stap 7: Vergelijking 8
  10. Als een validatie stap, REPLOT Ω C vs Vergelijking 10 en definieer de correlatie coëfficiënt. Hogere waarden dan 0,95 te verwachten zijn.
  11. Volgens de procedure zoals beschreven in stap 4, corrigeren de gemeten drift tijd van het doelwit eiwit of eiwit-complex: Vergelijking 7
  12. Kalibreer de drift tijd van het doelwit eiwit / eiwitcomplex met behulp van de exponentiële factor, X, gedefinieerd in Stap 7: Vergelijking 8
  13. Bereken Ω van het doelwit eiwit / eiwitcomplex met behulp van de fit-vastgestelde constante, A, gedefinieerd in Stap 7: Vergelijking 9 .
  14. Voor elke experimentele conditie, stap 2 tot 13 dient te worden herhaald. Bij het definiëren van de dwarsdoorsnede van het onbekende eiwit of eiwit-complex, raden we aan dat elk experiment ten minste drie keer worden herhaald, en de standaarddeviatie van deze metingen drievoud bepaald.

Deel 4: Het definiëren van drift tijd waarden

Vereiste software: MassLynx en Driftscope (Waters).

  1. Open de IM-MS spectrum met behulp van de Driftscope software.
  2. Vanuit het hoofdmenu View en verwijder het vinkje Chromatogram, Drift Tijd en Spectrum (optioneel), zodat alleen actief de 2D-kaart tonen drift tijd vs m / z.
  3. In de menubalk, kiest u Weergave | Opties | Toon Editor Panel en pas Intensity Drempelwaarden voor achtergrondgeluiden te minimaliseren (in de meeste gevallen, kan deze instelling worden gedefinieerd als Min = 30-40% en Max = 100% telt).
  4. Kies Display | 2D Navigatie Intensity Scale, en de drie opties zullen verschijnen: Lineaire schaal, log-schaal en Square Root Scale. Een keuze van de log-schaal (logaritmische data te transformeren) zal de intensiteit kleurcode te comprimeren, en in staat stellen een simultane verschijning van een breed scala aan intensiteiten (in tegenstelling tot de lineaire en de wortel-opties, waarmee alleen de meest intense pieken zichtbaar) .
  5. Vanaf de werkbalk paneel, Gebruik Selection Tool-knop. Deze optie activeert de verschillende selectie-opties, en maken de selectie van de relevante regio binnen het spectrum. De meest nauwkeurige tool is Enable Region of Interest Selecties, door middel waarvan een grens kan worden getrokken in de regio van belang zijn, dus met uitzondering van alle onnodige data en geluid pieken. Ook de Orthogonal en Band Keuzemogelijkheden zijn nuttig, toen de regio van belang niet wordt omgeven door redundante pieken.
  6. Zodra de regio van belang is geselecteerd, gebruikt u de Accept Huidige selectie opdracht om overbodige informatie te verwijderen.
  7. De gegevens exporteren naar MassLynx, met behoud van de drift tijd informatie.
  8. Binnen MassLynx, opent u het chromatogram van de opgeslagen drift tijd spectrum, en combineren de tijd bakken. De bijbehorende massaspectrum wordt automatisch geopend.
  9. Breng de functie verzachten door het definiëren van het raam grootte en het aantal gladde parameters (moeten specifiek worden afgestemd op elk spectrum, met behulp van minimale waarden).
  10. Van toepassing zijn baseline aftrekken, indien nodig.
  11. Midden van het spectrum en meten van de massa, naar eiwit identiteit en de nauwkeurigheid van massa's te valideren.
  12. Voor elke lading staat, combineren de m / z bereik. De bijbehorende drift tijd spectrum verschijnt automatisch. Glad en het centrum van de drift tijd profiel, en definieer de drift tijdswaarde door het aangeven van het zwaartepunt van elke piek.

Deel 5: representatieve resultaten

Figuur 1
Figuur 1. Schematische voorstelling van de Synapt HDMS instrument met vermelding van de belangrijkste instelbare parameters van de IMS-MS overname. Experimentele parameters die worden gebruikt voor het IM-MS metingen zijn gelabeld op basis van hun positie binnen het instrument. Het ion beam is gekleurd in het rood, en de druk in elke regio is aangewezen met behulp van een kleurcode. Het paneel aan de onderkant illustreert de potentiële gradiënt langs het instrument en de potentiële verschillen het definiëren van de Trap en de overdracht botsing energieën evenals de Bias potentieel. Alle mogelijkheden lezen-backs wordt verwezen naar de statische offset spanning die meestal ingesteld op 120V.

Figuur 2
Figuur 2. Ionen mobiliteit aankomsttijd distributies voor de Gβυ eiwit.

A. Een hoge T-wave velocity leidt tot een smalle verdeling van de drift tijd profiel. De plot laat de aankomsttijd verdeling van de 16 + (rood), 15 + (groen), 14 + (blauw) en 13 + (magenta) kosten staten, evenals de totale drift tijd-profiel (in zwart) van de G-βυ eiwit.

B. Een geoptimaliseerde drift tijd spectrum met een gladde Gaussische piekvorm. Dezelfde kleur als labels in A.

C. Een 'roll-over' effect, dat optreedt wanneer de tijd genomen voor ionen om de mobiliteit cel traverse is langzamer dan de interval tussen de injecties van de nieuwe ion-pakketten in het apparaat. Als gevolg hiervan, de uitgebreide drift tijd piek aan het begin van het spectrum. Dit effect kan worden weggenomen door het verhogen van de T-golfhoogte, en het verminderen van de T-golf snelheid en IMS druk.

D. Artificial 'rimpelingen' wordt veroorzaakt doordat de Transfer T-wave velocity en duwboten frequentie zijn gedeeltelijk gesynchroniseerd. Dit effect kan worden overwonnen door het aanpassen van ofwel de duwboot frequentie of Transfer T-wave velocity.

Figuur 3
Figuur 3. Het effect van ionen activering en gedeeltelijke denaturerende omstandigheden op IM-MS spectra van hemoglobine. Perceel van drift tijd versus m / z voor de tetrameer hemoglobine complex, met behulp van een waterige oplossing van 10 mM ammoniumacetaat (pH = 7,6) (A, C) en de toevoeging van 0,1% azijnzuur (B). Gegevens verkregen met behulp van Trap botsingsenergie spanning van 13 V (A, B) en 35 V (C) Hoewel in alle drie de panelen het massaspectrum (geprojecteerd op de top) lijkt, met een tetrameer betaling serie gecentreerd op 4000 m / z, de drift tijd-profiel (geprojecteerd op de zijkanten) is anders (totale drift tijdsverdeling isin het zwart, en de 16 + profiel is in rood). De langere tijd drift van de gedeeltelijk gedenatureerd monster verkregen in B, en de gas-fase ionen geactiveerd, verkregen in C, is kenmerkend voor een zekere mate van ontvouwing. Deze waarneming illustreert dat, hoewel de gemeten massa komt overeen met een intacte complex, de oplossing structuur is verstoord. Als gevolg daarvan, is een zorgvuldige controle van experimentele omstandigheden vereist.

Figuur 4
Figuur 4. Door het genereren van een ijklijn, drift tijd metingen en botsing doorsneden kunnen worden gecorreleerd.

A. Gemeten drift tijd waarden van de verschillende lading staten van paarden cytochroom C (cirkels), paard hart myoglobine (driehoeken) en runder ubiquitine (vierkanten) zijn uitgezet tegen de literatuur Ω waarden gecorrigeerd voor zowel ion laadtoestand en de gereduceerde massa. De pasvorm geeft een lineaire functie die overeenkomt met: ln (Ω C) = XLN (t D ') + A. De vastgestelde exponentiële factor (X), fit-bepaald constante (A), en de correlatie coëfficiënt worden weergegeven op het perceel voor de verkregen gegevens op een T-golf snelheid van 350 m / s, en een statische golfhoogte van 11 V. B. Een histogram van de correlatiecoëfficiënt distributies verkregen van 10 opeenvolgende kalibratie experimenten.

Eiwitmonster / Technische parameters GluFibrino-
peptide
monomeer
1,6 kDa
Myoglobine

monomeer
17 kDa
Hemoglobine

tetrameer
67 kDa
Transferrine

monomeer
80 kDa
GroEL

14-mer
801 kDa
Een back-druk, mBar 4.4 5.0 5.1 5.1 6.5
Trap druk, mBar 1.6x10 -2 2.4x10 -2 2.4x10 -2 2.6x10 -2 2.8x10 -2
IMS Druk, mBar 4.4x10 -1 4.4x10 -1 4.4x10 -1 4.4x10 -1 4.2x10 -1
Sampling cone voltage, V 46 80 80 80 118
Extractie kegel spanning, V 1.7 1 1 1 3
Bias spanning, V 20 20 25 25 50
Trap botsingsenergie, V 20 15 15 15 80
Overdracht botsingsenergie, V 5 12 12 12 15

Tabel 1. Experimentele voorwaarden gebruikt voor het analyseren macromoleculen.

Standaard Protein Moleculaire massa (m) Kosten (z) m / z Collision doorsnede (in 2)
Cytochroom C 12213 10 1222.3 2226
11 1111.3 2303
12 1018.8 2335
13 940,5 2391
14 873,4 2473
15 815,2 2579
16 764,3 2679
17 719,4 2723
18 679,5 2766
Myoglobine 16952 11 1542.1 2942
12 1413.7 3044
13 1305.0 3136
14 1211.9 3143
15 1131.1 3230
16 1060.5 3313
17 998,2 3384
18 942,8 3489
19 893,2 3570
20 848,6 3682
21 808,2 3792
22 771,6 3815
Ubiquitine 8565 8 1071.6 1442
8 1071.6 1622
9 952,7 1649
10 857,5 1732
11 779,6 1802

Tabel 2. Kalibratieoplossing eiwitten en hun botsing doorsneden waarden bepaald door de conventionele IMS maatvoeringen 14.

Apparaten Vennootschap Catalogus nummer
Synapt HDMS-32K RF-generator Waters Ltd
P-97 Flaming-Brown micropipet puller Sutter Instrumenten P-97
Sputter coater Electron Microscopy Sciences EMS550
Binoculaire microscoop Nikon
Reagentia Vennootschap Catalogus Nummer
Ammoniumacetaat Sigma-Aldrich Sigma, A2706
CsI ​​99,999% Sigma-Aldrich Aldrich, 203033
Methanol Sigma-Aldrich Fluka, 34966
Azijnzuur Fisher Scientific AC12404
Equine myoglobine (van paard hart) Sigma-Aldrich M1882
Equine cytochroom c (van paard hart) Sigma-Aldrich C-2506
Runderen ubiquitine (van rode bloedcellen) Sigma-Aldrich U6253
Hemoglobine Sigma-Aldrich H2625
Gas Reacties
Stikstof, 99,999% zuiver 8 kubieke meter cilinder
Argon, 99,999% zuiver 8,8 kubieke meterscylinder

Tabel 3. Reagentia en apparatuur.

Discussion

Het protocol hier beschreven staat het definiëren van de botsing doorsnede van eiwitten of eiwitcomplexen met een onbekende driedimensionale structuur, met als doel het verstrekken van informatie over hun algemene vorm, subunit verpakking en topologie. Daartoe eens botsing doorsnede waarden worden weergegeven is het noodzakelijk om deze waarden om te zetten in structurele details. Dit proces vereist extra experimentele inspanningen en computationele analyse, die hieronder kort worden besproken.

Om te beginnen, is het raadzaam om eiwitten of eiwitcomplexen te analyseren met bekende structuren. Deze metingen kunnen een nuttige kwaliteitscontrole van de methodologie en de nauwkeurigheid beoordeling van de verwerving parameters kunnen door het vergelijken van de theoretische en gemeten Ω waarden. De theoretische dwarsdoorsneden kunnen worden berekend op basis van de kristalstructuur coördineert het gebruik van de MOBCAL 15,16 software, die een open source FORTRAN gebaseerde software waardoor code editing afhankelijk van de operator nodig heeft. Voor het uitvoeren van dergelijke berekeningen is het noodzakelijk om het programma zodanig dat het aantal van iteratieve berekeningen die zijn uitgevoerd per ingang structuur is verhoogd en dat de coördinatie van bestanden met groot aantal atomen worden geaccepteerd 1 te wijzigen.

Een IM-MS strategie voor het definiëren van topologische arrangementen van subeenheden binnen multicomponent assemblies is onlangs voorgesteld 4,6. Bij deze methode wordt de bewaking van dissociatie paden van verzamelingen van eiwitten tot kleinere componenten. Deze dissociatie wordt bereikt door gecontroleerde aanpassing van de oplossing voor de omstandigheden, die aanleiding geeft tot een verdeling van subcomplexes een afspiegeling is van de "bouwstenen" van de assemblages. De gelijktijdige meting van Ω waarden van zowel de intacte complexe en demontage producten genereert structurele beperkingen die vervolgens worden gebruikt voor het berekenen van topologische modellen van de eiwitcomplexen. Het uitgangspunt ten grondslag liggen aan deze methodiek is dat de gegenereerde subcomplexes hun moedertaal-achtige bevestigingen te behouden, ja en recente studies hebben aangetoond dat de oplossing structuur van de demontage producten gehandhaafd blijft en er geen grote herschikking in een van beide oplossing of gas fases hebben plaatsgevonden 4,6.

De laatste stap in de toewijzing van quaternaire structuur om gas-fase-eiwit complex ionen is de montage van de botsing doorsnede waarden computer gegenereerde modellen. Modeling benaderingen zijn gebruikt om de verschillende mogelijke topologische arrangementen van subeenheden en hun in silico Ω worden berekend en vergeleken met de experimentele degenen te verkennen. Op dit moment slechts een paar computationele benaderingen worden gebruikt, zoals de spheretype grofkorrelige methode die de diameter van subeenheden 1,8 benadert. Over het geheel, dit gebied is nog in zijn vroege jaren en de verdere ontwikkeling nodig is om deze aanpak generiek, en toepasbaar op een breed scala van complexen.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgements

De auteurs bedanken de Sharon leden van de groep voor hun kritische review, en voor hun bijdrage aan het manuscript. We zijn dankbaar voor de steun van de Morasha en Bikura Programma's, de Israel Science Foundation (Grant nrs. 1823-1807 en 378/08), de Josef Cohn Minerva Centrum voor biomembraan onderzoek, de Chais Family Fellows Program voor New Scientists, de Abraham en Sonia Rochlin Foundation; de Wolfson Family Charitable Trust, het Helen en Milton A. Kimmelman Centrum voor Biomoleculaire Structuur en assemblage, het landgoed van Shlomo en Sabine Beirzwinsky; Meil ​​de Botton Aynsley, en Karen Siem, Verenigd Koninkrijk.

References

  1. Ruotolo, B. T. Ion mobility-mass spectrometry analysis of large proteincomplexes. Nat Protoc. 3, (7), 1139-1152 (2008).
  2. Scarff, C. A., Thalassinos, K., Hilton, G. R., Scrivens, J. H. Travelling wave ion mobility mass spectrometry studies of protein structure: biological significance and comparison with X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance spectroscopy measurements. Rapid Commun Mass Spectrom. 22, (20), 3297-3304 (2008).
  3. Smith, D. P. Deciphering drift time measurements from travelling wave ion mobility spectrometry-mass spectrometry studies. Eur J Mass Spectrom (Chichester, Eng). 15, (2), 113-130 (2009).
  4. Leary, J. A. Methodology for measuring conformation of solvent-disrupted protein subunits using T-WAVE ion mobility MS: an investigation into eukaryotic initiation factors. J Am Soc Mass Spectrom. 20, (9), 1699-1706 (2009).
  5. Lorenzen, K. Determination of stoichiometry and conformational changes in the first step of the P22 tail assembly. J Mol Biol. 379, (2), 385-396 (2008).
  6. Pukala, T. L. Subunit architecture of multiprotein assemblies determined using restraints from gas-phase measurements. Structure. 17, (9), 1235-1243 (2009).
  7. van Duijn, E. Chaperonin complexes monitored by ion mobility mass spectrometry. J Am Chem Soc. 131, (4), 1452-1459 (2009).
  8. Ruotolo, B. T. Evidence for macromolecular protein rings in the absence of bulk water. Science. 310, (5754), 1658-1661 (2005).
  9. Ruotolo, B. T., Robinson, C. V. Aspects of native proteins are retained in vacuum. Curr Opin Chem Biol. 10, (5), 402-408 (2006).
  10. Giles, K. Applications of a travelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide. Rapid Commun Mass Spectrom. 18, (20), 2401-2414 (2004).
  11. McKay, A. R., Ruotolo, B. T., Ilag, L. L., Robinson, C. V. Mass measurements of increased accuracy resolve heterogeneous populations of intact ribosomes. J Am Chem Soc. 128, (35), 11433-11442 (2006).
  12. Ruotolo, B. T. Ion mobility-mass spectrometry reveals long-lived, unfolded intermediates in the dissociation of protein complexes. Angew Chem Int Ed Engl. 46, (42), 8001-8004 (2007).
  13. Morton, V. L., Stockley, P. G., Stonehouse, N. J., Ashcroft, A. E. Insights into virus capsid assembly from non-covalent mass spectrometry. Mass Spectrom Rev. 27, (6), 575-595 (2008).
  14. Valentine, S. J., Counterman, A. E., Clemmer, D. E. A database of 660 peptide ion cross sections: use of intrinsic size parameters for bona fide predictions of cross sections. J Am Soc Mass Spectrom. 10, (11), 1188-1211 (1999).
  15. Mesleh, M. F. Structural information from ion mobility measurements: effects of the long-range potential. J Phys Chem. 100, 16082-16086 (1996).
  16. Shvartsburg, A. A., Jarrold, M. F. An exact hard-spheres scattering model for the mobilities of polyatomic ions. Chem Phys Lett. 261, 86-91 (1996).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics