Photoconversion renat fluorescerande proteiner och Dual-probe optisk markering i levande celler

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Detta protokoll beskriver en allmän strategi för att utföra photoconversion av fluorescerande proteiner på en konfokala laserskanning mikroskop. Vi beskriver förfaranden för photoconversion av puried protein prover, samt för dual-sond optisk lyfta i levande celler med mOrange2 och Dronpa.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kremers, G., Piston, D. Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells. J. Vis. Exp. (40), e1995, doi:10.3791/1995 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Photoconvertible fluorescerande proteiner (PC-FPS) är en klass av fluorescerande proteiner med "optisk överstrykningspenna" funktion, vilket innebär att färgen på fluorescensen kan ändras av exponering för ljus av en viss våglängd. Optisk lyfta möjliggör noninvasiv märkning av en subpopulation av fluorescerande molekyler, och är därför idealisk för att spåra enskilda celler eller organeller.

Kritiska parametrar för effektiv photoconversion är intensiteten och exponeringstiden för photoconversion ljus. Om intensiteten är för låg, kommer photoconversion vara långsam eller inte förekomma alls. Å andra sidan kan för mycket intensitet eller för lång exponering photobleach proteinet och därmed minska effektiviteten i photoconversion.

Detta protokoll beskriver en allmän riktlinje hur man ställer in en konfokala laserscanning mikroskop för PC-FP photoconversion applikationer. Först beskriver vi en ordning för beredning renat prover protein droppe. Detta prov formatet är mycket bekvämt för att studera fotofysiska beteende fluorescerande proteiner under mikroskop. För det andra kommer vi att använda provet proteinet droppen för att visa hur man konfigurerar mikroskop för photoconversion. Och slutligen, visar vi hur du utför optisk lyfta i levande celler, inklusive dubbla givare optiska markera med mOrange2 och Dronpa.

Protocol

1. Beredning av fluorescerande prover protein droppe

En fluorescerande proteinet droppe Urvalet består av ett 1-octanol/water emulsion med fluorescerande proteinet som bor i vattenfasen. Denna emulsion är inklämt mellan ett objektsglas och en 22 mm fyrkant skyddsglas för mikroskopi applikationer.

  1. Innan fluorescerande proteinet prover droppe på objektglas och glas täcka behöver rengöras och överdragna med ett vattenavvisande medel.
  2. Rengör glas genom tvättning 5 minuter med aceton och låt torka med flyg. (Alternativt kan efter rengöring av glas behandlas i 30 sekunder i en plasma renare för att erhålla optimal beläggning resultat).
  3. Bered en 2% metyltrimetoxisilan lösning i aceton och täck de glas under en 2 minuters inkubation i denna lösning. Efter beläggning bort glas från lösningen och låt torka med flyg. Skölj sedan med 70% etanol från en sprayflaska och låt torka igen. (Frivilligt och på denna punkt glas kan bakas i 1 timme vid 80 ° C kovalent att länka beläggningen på glas). Belagda glas kan lagras i minst en månad.
  4. Fluorescerande proteiner renas som Hans 6-taggade proteiner från E. Coli 1. Mät absorbansen spektrum av renat protein och förbereda ett lager utspädning med en optisk densitet på ~ 0,1 i Ste buffert (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA), som innehåller 0,1% bovint serumalbumin (BSA) . Dessutom förbereder 10 ml av en 1:01 blandning av 1-oktanol och STE buffert i ett 15 ml koniskt rör och blanda kraftigt. Efter blandning lämnar tills fasseparation är klar. Den översta fasen är det 1-oktanol. (Varning: Eftersom 1-oktanol har en stark lukt är det viktigt att använda en sluten avfallsbehållare för allt som kommer i kontakt med 1-oktanol.)
  5. För att göra emulsionen pipetten 45 l 1-oktanol och 5 l fluorescerande protein i ett mikrofugrör. Knacka på röret några gånger med fingret för att starta bildandet av emulsionen och därefter Sonikera röret i 30 sekunder i en sonication bad. Under tiden får en belagd objektsglas och skyddsglas redo. Efter sonication emulsionen ska vara helt grumlig. Omedelbart efter sonication pipett 4 l emulsion från mitten av röret på en belagd objektglas och täck med ett belagt skyddsglas.
  6. Om försöket görs på rätt sätt emulsionen ska fördelas jämnt mellan objektglas och objektet glas. Inom några minuter provet ska vara stabil, bestående av ~ 10 mikrometer tjockt fluorescerande droppar med olika diameter. Den största dropparna är nära centrum av provet och de mindre finns vidare mot kanterna.

2. Ställa in en photoconversion experiment

Följande procedur är en allmän strategi för inrättandet av ett fluorescerande experiment protein photoconversion. Detta förfarande kan tillämpas för renade proteiner samt för levande celler.

  1. Följande parametrar ge en allmän utgångspunkt för att ställa in din photoconversion experiment:
    40x 1.3NA oljeimmersion mål
    Bildstorlek = 512 x 512 pixlar
    Scan zoom = 4

    Pixel uppehållstid = 6 μsec.
    Z-upplösning (hål storlek) = 3 ìm
  2. Konfigurera två upptäckt kanaler för inledande och photoconverted fluorescens, samt en "photoconversion kanal". I detta exempel kommer vi att använda renat mOrange2 protein, som är ett orange-till-röda photoconvertible fluorescerande protein. Den orange arter detekteras med hjälp av 561 nm excitation och fluorescens samlas mellan 570 nm och 630 nm. Den photoconverted röda arter upptäcks med hjälp av 633 nm excitation och fluorescens samlas mellan 640 nm och 700 nm. För "photoconversion kanalen" välj 488 nm excitation och samla fluorescens mellan 490 nm och 540 nm. (Obs:. Avbildas photoconversion kanalen inte är absolut nödvändigt)
  3. Använd kanal för avbildning de första fluorescens med kontinuerlig scanning för att justera lasern makt och detektor förstärkning för optimal bildkvalitet.
  4. Aktivera photoconversion kanal och väljer en låg lasereffekt. Starta avbildning en serie tid förflutit och gradvis öka photoconversion lasern tills signifikant blekning av den ursprungliga fluorescens iakttas. Fortsätta skanna tills den första fluorescens är cirka 75% blekt.
  5. Inaktivera photoconversion kanalen och aktivera upptäckt kanal för photoconverted fluorescens. Starta avbildning med hög detektor vinst och låg laser makt och gradvis öka lasereffekten tills photoconverted fluorescens upptäcks. När du upptäcka photoconverted fluorescens kan du justera laser makt och detektor förstärkning för optimal bildkvalitet.
  6. Slutligen använde lasereffektför photoconversion samt varaktighet photoconversion behöver optimeras. Ökad makt photoconversion laser kommer att påskynda takten i photoconversion dock för mycket laser makt kommer photobleach proteinet.
  7. När den optimala photoconversion lasereffekten och varaktighet har fastställts, kan dessa parametrar användas för att konfigurera en standard fotoblekning eller FRAP modul och "photoconversion kanal" inte längre behövs.

3. Dual-sond optiska markera med mOrange2 och Dronpa

På grund av den röda skiftade-spektrala egenskaper kan mOrange2 användas i kombination med den gröna photoswitchable fluorescerande protein Dronpa för dual-probe optiska belyser att tillåta selektiv markering av 4 enskild cell (organell) populationer.

  1. Celler odlas i Mattek glas botten rätter och transfekterade 24 timmar innan avbildning med standard Lipofectamine2000 transfektion 1.
  2. Ställ in mikroskop för mOrange2 photoconversion som beskrivs i avsnitt 2.
  3. Konfigurera mikroskop för Dronpa photoswitching. Dronpa fluorescens kan avbildas med mOrange2 "photoconversion kanal" (se steg 2.2). (Obs: Minimera lasereffekten används för avbildning Dronpa, eftersom för mycket laser makt kommer att orsaka inaktivering av Dronpa.) Lägg till en kanal för Dronpa fotoaktivering. Vi använder 800 nm två-photon excitation för fotoaktivering, men alternativt detta kan uppnås med hjälp av 405 nm excitation. Bestäm laser effekt som krävs för bildhantering, fotoaktivering och photoinactivation av Dronpa fluorescens.
  4. Varning: Photoconversion av mOrange2 och inaktivering av Dronpa både uppträda när 488 nm excitation. Grund av den höga laser effekt som krävs för mOrange2 photoconversion detta kommer också att inaktivera Dronpa fluorescens. Å andra sidan, inträffar Dronpa inaktivering redan vid mycket lägre laser makt och kan utföras utan betydande mOrange2 photoconversion.
  5. När parametrarna för mOrange2 photoconversion och Dronpa photoswitching är inställda, är dubbel sond optisk lyfta uppnås genom följande steg. Först inaktivera Dronpa fluorescens i hela synfältet med låg effekt 488 nm excitation. För det andra, välj ett område av intresse och photoconvert mOrange2 med hög effekt 488 nm excitation. Slutligen, välj en region av intresse att aktivera Dronpa fluorescens.

4. Representativa resultat

Figur 1
Figur 1. Droplet provberedning. A) Korrekt beredd droppe prov. B) Exempel på förberedd utan beläggning objektglas och täck glas. C) Exempel på förberedd utan att lägga till 0,1% BSA.

Figur 2
Figur 2. Effekt av photoconversion laser makt och varaktighet på mOrange2 photoconversion. Enstaka droppar innehåller mOrange2 protein har kontinuerligt photoconverted med olika mängder av 488 nm laser makt. Relativ lasereffekt används för photoconversion var 10% (fast), 25% (streckad) och 100% (streckad). A) Orange fluorescerande arter. B) Photoconverted rött fluorescerande arter.

Figur 3
Figur 3. Dual-sond optiska markera med mOrange2 och Dronpa. A) cell som uttrycker mOrange2-Histon H2B och Dronpa-Mito innan photoconversion, visar apelsin fluorescens i kärnan och grön fluorescens i mitokondrierna. B) Dronpa fluorescensen var avstängd med låg effekt 488 nm excitation och orsakar minimal photoconversion av mOrange2. C) mOrange2 var photoconverted till rött med hög effekt 488 nm excitation. D) Dronpa fluorescensen var påslagen igen med 800 nm 2-photon excitation. Panelerna är överlägg av fluorescens bilder tillsammans med differential interferens kontrast bild.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det renade fluorescerande proteinet droppe prov är ett mycket praktiskt prov format för fotofysiska karakterisering av fluorescerande proteiner, till exempel att studera fotoblekning kinetik och kinetik photoconversion. Den extremt liten droppe volym (~ 20 pikoliter) underlättar fotoblekning och experiment photoconversion, vilket kan vara svårt att utföra i kyvett-baserade system. Dessutom, som visas här droppen provet är idealisk för att inrätta ett konfokalmikroskop för photoconversion applikationer. Den hydrofoba beläggningen och förekomsten av BSA är viktiga för att få homogena droppar. Utan beläggning dropparna tenderar att vara klämd mot en av de glasytor och i avsaknad av BSA den fluorescerande proteinet brukar samlas vid 1-octanol/water gränssnittet, skapar en gloria av fluorescens (figur 1).

Fluorescerande proteinet photoconversion betraktas ofta som ett alternativ till fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP), med den fördelen att man också kan följa photoconverted arter. Det är dock viktigt att beakta att photoconversion är helt beroende av att använda laser makt. För mycket photoconversion lasereffekt eller för lång exponering kan orsaka fotoblekning snarare än photoconversion, vilket minskar mängden photoconverted fluorescens (figur 2).

Den röd-skiftade spektrala egenskaper mOrange2 och dess photoconverted arter tillåta dubbla prob optisk markera med ett grönt fluorescerande optisk överstrykningspenna. Detta kan antingen vara en photoswitchable fluorescerande protein (Dronpa), vilket visas här, eller alternativt en photoactivatable fluorescerande proteinet, exempelvis PA-GFP. Dronpa har fördelen att man kan kontrollera sin närvaro i början av experimentet. Å andra sidan, komplicerar användningen av Dronpa optisk markering, eftersom alla Dronpa fluorescens måste vara inaktiverat först, och det faktum att Dronpa fluorescens så småningom är avstängd under avbildning. Dessa komplikationer är mindre djupgående vid användning av PA-GFP, utan kontroll av förekomsten av PA-GFP innan fotoaktivering kan vara svårare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Vi tackar Mike W. Davidson (Florida State University) att ställa plasmid-DNA-kodning fluorescerande proteiner. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag GM72048 (till DWP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microsope slides VWR international 48312-003
22 mm cover glass Corning 2940-245
1-octanol Sigma-Aldrich O4500
methyltrimethoxysilane Sigma-Aldrich M6420
MatTek dishes MatTek Corp. P35G-1.5-14-C
Lipofectamine2000 Invitrogen 11668-019

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. Photoconversion in orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 6, 355-358 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics