Первичные культуры нейронов из мозга дрозофилы поздней стадии куколки

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Это видео демонстрирует подготовки первичных нейронов культур из мозга дрозофилы поздней стадии куколки. Просмотров живых культур показывают результат аксонов и отображения уровня кальция использованием Фура-2.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sicaeros, B., Campusano, J. M., O'Dowd, D. K. Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae. J. Vis. Exp. (4), e200, doi:10.3791/200 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

В этом видео, мы демонстрируем подготовки первичных нейронов культур из мозга дрозофилы поздней стадии куколки. Процедура начинается с удаления из мозга животных на 70-78 часов после пупария образования. Изолированные мозги показываются после краткой инкубации в папаин последовало несколько моет в бессывороточной ростовой среды. Процесс механической диссоциации каждой мозга в 5 мкл капли СМИ на покровное иллюстрируется. Аксонов и дендритов после митотического нейроны sheered с рядом сома в период раздробленности, но нейроны начинают восстанавливать процессы в течение нескольких часов обшивки. Изображения показывают живые культуры на 2 дня. Нейроны продолжить разработку процессов в течение первой недели в культуре. Конкретные нейронные популяции могут быть идентифицированы в культуре использованием GAL4 линии ездить ткани конкретное выражение флуоресцентные маркеры, такие как GFP и RFP. Всего записей ячейки продемонстрировали культурные нейроны формируют функциональные, спонтанно активных холинергической и ГАМК-синапсы. Короткий сегмент видео иллюстрирует динамику кальция в нейроны культурный использованием Фура-2 в качестве красителя показатель кальция для контроля спонтанной переходных кальция и никотина вызвала ответы кальция в блюдо культурный нейронов. Эти куколки культур мозга полезной модели системы, в которой генетические и фармакологические средства могут быть использованы для определения внутренних и внешних факторов, которые влияют на формирование и функции центральных синапсов.

Protocol

Подготовка до дня культивирования:

  1. Сделать стерильной рассекает решение.
  2. Сделать стерильной DMEM и храните в 10 мл аликвот при 4 ° С в течение 2 недель.
  3. Сделать стерильной DDM2 добавки и заморозить в 50 или 100 мкл аликвоты в течение 1 месяца.
  4. Сделать ConA / ламинин.
  5. Пальто покровные.
    Дополнительно: Сделать стерильной CNBM и хранить замороженными до 4 месяцев.

В день культивирования

I. Подготовка раствора фермента (ES) в ламинарном потоке капот

  1. Положите 5 мл рассекает решение (DS) в 15 мл центрифужную пробирку.
  2. Взвесить 0,8 мг L-цистеин в 0,6 мл Eppendorf и добавить 150 мкл DS. Внесите вверх и вниз, пока кристаллы не ушли.
  3. Добавить 150 мл DS / цистеина в 5 мл DS и хорошо перемешать.
  4. Добавить 50 U (единиц) папаин.
  5. Добавить 7 мл 0,1 N Na ОН и хорошо перемешать. Решение будет ясно в течение 30 мин. при активации.
  6. Фильтры решение фермента с 0,2 мм шприц фильтр в стерильный 1,5 мл винт трубки микроцентрифужную крышкой

    Папаин: Хотите 50 ЕД в 5 мл DS. Каждая партия несколько отличается, поэтому необходимо рассчитать, сколько:
    37,3 мг / мл и 28,3 ед / мг
    37,3 х 28,3 = 1055,59 ед / мл (1000 мл)
    50 U = 47,4 мл

II. Сделать DDM2 СМИ

В день культивирования: добавить следующие дополнения, чтобы сделать DDM2

К 10 мл DMEM добавить добавки, как раз перед культивирования:

  1. 100 мкл трансферрина
  2. 100 мкл путресцин
  3. 100 мкл Селен
  4. 100 мкл Прогестерон
  5. 50 мкл инсулина
  6. 10 мкл 20-гидроксиэкдизона

Примечание: достаточно DDM2 для всех культур запланированных (каждый мозга высевали на одном покровное в отдельных 35 мм блюдо Петри, 1,5 мс СМИ / культура)

Шаг III-VI может быть сделано нестерильных скамейке лаборатории и должен быть завершен в течение 45 минут или меньше.

III. Куколки коллекции

  1. Выберите 10-15 куколки из сторон флакон под рассекает микроскопом.
  2. Место куколки в крышке сухой 35 мм блюдо Петри.

Примечание: Мы обычно используем мозг из куколок между 55-78 часов после пупария образования (НПФ). Это немного труднее вскрыть из мозга от младшего куколки с головой капсулы имеют тенденцию к краху, в то время как общий уровень аксонов несколько ниже из старейших куколок. В Canton-S штамм дикого типа, эти этапы признаны пигментированные глаза, светло-коричневые или слегка красноватый, с небольшим пигмента в другом месте.

IV. Обезглавливание при вскрытии микроскопом

  1. Место две капли стерильного рассекает решение в крышку чашки Петри, рядом с куколками.
  2. Аккуратно прижмите одну куколку с тонкими щипцами в левой руке и использовать 27 калибр иглы шприца прилагается к 1 мл шприц в правую руку, чтобы удалить кутикулу на переднем конце тела куколки.
  3. Сожмите куколки слегка щипцами и головой, как возникает использовать 27 иглы разорвать шею.
  4. С кончика иглы или пинцета, передача головы до капли рассекает решение.
  5. Повторяйте, пока у вас есть 10-15 голов в одной капли.

В. Удаление мозг от головы под микроскопом рассекает

  1. В каждой руке держать 1 мл шприц с иглой 27.
  2. Используйте их, чтобы положение лететь головой в капле рассекает решения, чтобы хоботок стоит перед вами и спинной поверхности головы на север.
  3. Вставьте левую иглу в хоботок, чтобы прикрепить голову вниз и правой иглы, чтобы сделать щель в правый глаз, который идет от брюшной части спинной поверхности.
  4. Вставьте правую иглу рядом с левой в области хоботка, а затем использовать левую спицу, чтобы мягко подавляют кутикулы над левым глазом, подталкивая мозг к щели в правый глаз. Мозг должен выйти из щели на правом, относительно нетронутыми, часто с обеих оптических сеБес еще привязаны, а иногда пигментированные ткани глаза, а также.
  5. Нажмите мозга на спину иглу и трансфер в каплю стерильного физиологического раствора в рассекает новые стерильные, 35 мм блюдо Петри.
  6. Сбор 10-15 мозг для каждого генотипа.

VI. Удаление оптических долях и обработки ферментом

  1. В каждой руке держать 1 мл шприц с иглой 27 и использовать их, чтобы собрать все мозги в одном небольшом участке капли рассекает решение
  2. Использование шприцев в качестве режущего инструмента для удаления зрительных долях мозга от каждого так ткани оставшихся для культуры центральной области мозга.
  3. Используйте 20 мкл pipetman, заход в 5 мкл, чтобы передать все мозги одного генотипа к трубке Эппендорф, содержащий 1 мл стерильного раствора папаин.
  4. Мозги инкубировали в папаин в течение 10-15 минут на ротатор установлен на уровне 60 оборотов в минуту.
  5. Центрифуга при 3000 оборотов в минуту в течение 3 минут.

Внутри стерильной ламинарном боксе - все шаги, где ткань подвергается воздействию воздуха должно быть сделано в ламинарный поток капот для оставшихся шагов.

VII. Мытье

  1. Удалить ферментный раствор и заменить стерильными рассекает решение.
  2. Центрифуга при 3000 оборотов в минуту в течение 3 минут.
  3. Промыть стерильной рассекает решение общей сложности 3 раза.
  4. Удалить рассекает засоленных и заменить DDM2.
  5. Центрифуга и мыть всего 2 раза с DDM2.
  6. Передача мозги и СМИ, чтобы стерильные 35 мм блюдо Петри.

VIII. Растирание и покрытие под микроскопом рассекает

  1. Место 5 мкл DDM2 в центре покровное.
  2. Передача 1 мозгу эту каплю DDM2 с желтым кончиком.
  3. Под микроскопом, использовать 27 игл колеи на кости до мозга на мелкие кусочки (если взять <1 минуты).
  4. Под визуальным руководством, сломать кончик стеклянной пипетки, которая тянется к тонкий момент, так что большие куски можно осторожно засасывается в кончике пипетки и выслан обратно в среду. Мы используем рот всасывания труб, которые поставляются с 100 мкл гематокрита капиллярное стекла.

    Примечание: Будьте осторожны, чтобы не получить пузырьков в средствах массовой информации и вам необходимо эмпирически определить оптимальный размер пипетки в использовании. Хорошие позволяют отделить мозг с отдельных клеток и еще некоторые крупные комки, приблизительно через 30 секунд / мозга. Когда вы смотрите на эти при более высокой мощности, примерно 10-20% нейронов должна все еще есть некоторые процессы оставшихся и еще будет несколько больших комков. Если вы диссоциируют слишком много, то все клетки будут круглые и они будут иметь устойчивый так много вреда они не выживут. Этот шаг требует практики и должно быть сделано быстро, так как существует большое отношение поверхности к объему и осмотического давления и рН капли DDM2 может быстро измениться. Ткань должна быть помещена в CO 2 инкубаторе как можно быстрее.

  5. Напишите на крышке чашки Петри: «Генотип, дата и время".
  6. Положите 35 мм чашки Петри в 100 мм блюдо Петри (с мокрой kimwipe), а поселиться в CO 2 инкубаторе в течение 30 мин.
  7. Потоп 35 мм блюдо с 1,5 мл DDM2.
  8. Держите культур в инкубаторе при 5% СО 2 инкубатора (23 ° С).

    Примечание: Если у вас нет доступа к охлаждению CO 2 инкубатора, использование стандартных тканей млекопитающих культуры инкубатор и либо поместить его в прохладном помещении и нагреть до 23 ° C, или положить в лаборатории, выключите темп, и использовать льда в лоток в нижней части инкубатора регулировать темп вокруг окружающей среды.

IX. Кормление Клетки

  1. На День 1 (следующий день), добавить 0,5 мл CNBM/B27 (условные СМИ), чтобы сделать 3:01 DDM2: CNBM/B27.
  2. На 5-й день заменить 1 мл среды для 3:01 DDM2: CNBM/B27.
  3. Продолжайте кормление клеток с 3:01 DDM2: CNBM/B27 каждые 4-5 дней.

    Примечание: культур можно выращивать без не-нейронных кондиционированной среде, но нейроны появляются чуть более хрупкими и более трудны для использования в экспериментах электрофизиологии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Нейроны найденным на мозг эмбриональных / послеродовой грызуны могут быть выращены в первичной культуре клеток, где они распространяются невриты и форма функциональной синаптических связей. Методы подготовки этих культур, хорошо известны и учится в грызунах нейронных культур сыграли решающую роль в идентификации генов и экологических факторов, участвующих в регуляции формирование синапса и функция (банкир и Гослин, 1991). Хотя насекомых нейронов из различных видов также может быть выращен в культуре, только нейроны насекомых показано, формируют функциональные синаптических связей в культуре от дрозофилы (Rohrbough и др., 2003). Нейробластов собрано середины гаструлы дрозофилы эмбрионов, выращенных в питательных средах с определенным привести к нейронам, которые являются электрически возбудимыми и форма функциональной, межнейронных синаптических связей (О'Дауд, 1995; Ли и О'Дауд, 1999). Для выявления факторов, которые регулируют синаптическую формы и функции в нейронах, как известно, участвует в качестве посредника взрослого поведения, мы разработали технику показано в этом видео для уборки и выращивания нейронов из мозгов поздней стадии дрозофилы (Су и О'Дауд, 2003). Одной из ключевых особенностей этой процедуры заключается в использовании папаин, вместо того, коллагеназа или другие агрессивные ферменты, которые традиционно используются в подготовке насекомых нейронных культур. Папаин результатов в диссоциированных нейронов сохраняя короткое аксонального процессы, которые выживают, регенерируют neuritic процессы и формы функциональных межнейронных синаптических связей. Всего записей в определенных клеточных популяций, в том числе грибов тела Кеньон клеток, показали, что быстрые возбуждающие синаптической передачи в культуре опосредуется nAChRs в то время как торможение опосредуется ГАМК рецепторы (Су и О'Дауд, 2003). Наши недавние электронно-микроскопического анализа показывают, что нейроны в синапсах культуры форму с структурными особенностями, которые похожи на химических и электрических синапсов в мозгу взрослого (О соавт., 2007). Как показано на видео, культуры, также поддаются Фура-2 исследования кальция изображений, и мы использовали эти исследовать механизмы, лежащие сотовой спонтанных и вызванных изменениями внутриклеточного уровня кальция в определенных клеточных популяций в том числе Кеньон клеток и холинергических нейронов (Jiang и др. др., 2005;. Campusano и др., 2007).. При обширных генетических набор инструментов доступен в дрозофилы этой культуры система обеспечивает очень полезным инструментом для выявления внутренних и внешних регуляторов центральной структуры синапсов, функции и пластичность.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана NIH грант NS27501 к DKOD. Дополнительная поддержка для этой работы был предоставлен грант на UC Irvine в поддержку DKOD в рамках Программы профессор HHMI.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Concanavalin A Sigma-Aldrich C-2010 To 2.5 ml DS, add 25 mg Concanavalin A bottle. This is 10 mg/ml concentration.Make aliquots of 90 ul and store at -20 C, no longer than 3 months.
Laminin Sigma-Aldrich L-2020 Add 1ml DS to 1mg Laminin bottle. This is 0.5 mg/ml concentration.Make aliquots of 10 ul and store at -20 C, no longer than 3 months.
Coverslips Bellco Glass 1943-00012 12 mm glass coverslips
ConA + Laminin solution Stock solution, from Con A stock and laminin stock, for coverslip coating: Add in 5 ml DS, 83.5 ul of ConA (167 ug/ml) and 8.35 ul of Laminin (0.835 ug/ml). Mix.Make aliquots of 100 ul and store at -20 C, not longer than a month.
Dissecting Solution Buffer For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C.
Dissecting Solution Buffer For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C.
Solution B: HEPES Buffer Sigma-Aldrich H-3375 20.97g (9.9mM). Add ultra filtered water up to 200 ml. Mix until dissolve and bring final volume to 250 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution B" and store at 4 C.
Solution A Buffer For 500 ml: 80.0g (137 mM) NaCl (Sigma S-9625) + 4.0g (5.4mM) KCl (Sigma P-4504) + 0.24g (0.17mM) Na2HPO4 (Sigma S-0876) + 0.3g (0.22 mM) KH2PO4 (Sigma P-5379).Weigh out all ingredients and mix until dissolved with 400 ml ultra filtered water. Bring final volume to 500 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution A" and store at 4°C.
Coating Coverslips:Put autoclaved coverslips in a 60 mm petri dish.Pipet 5 ul of Con A/Laminin mix onto center of each coverslip.Place in 37 C incubator for 2 hours.Rinse 3x coverslips with 100 ul of autoclaved water each. Use vacuum attached to a sterile Pasteur pipet.During the last rinse, pick up the coverslip with forceps and dry both sides.Transfer the coverslip to a 35mm Petri dish.Store at room temperature for up to a month.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. MIT Press. Cambridge. (1991).
  2. Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and Modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System. J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).
  3. O'Dowd, D. K. Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium. J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).
  4. Lee, D., O'Dowd, D. K. Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons. J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).
  5. Su, H., O'Dowd, D. K. Fast synaptic currents in Drosophila mushroom body Kenyon cells are mediated by alpha-bungarotoxin-sensitive nAChRs and picrotoxin-sensitive GABA receptors. J. Neurosci. 23, 9246-9253 (2003).
  6. Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels. J. Neurophysiol. 94, 491-500 (2005).
  7. Campusano, J. M., Su, H., Jiang, S. A., Sicaeros, B., O'Dowd, D. K. nAChR-mediated calcium responses and plasticity in Drosophila Kenyon cells. Develop Neurobiol. 67, 1520-1532 (2007).
  8. Oh, H. -W., Campusano, J. M., Hilgenberg, L. G. W., Sun, X., Smith, M. A., O'Dowd, D. K. Ultrastructural analysis of chemical synapses and gap junctions between Drosophila brain neurons in culture. Develop Neurobiol. (2007).

Comments

4 Comments

  1. Why are you using CO² incubator if these are insect cells and not mammalian?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 24, 2008 - 1:20 PM
  2. Could you please give the concentrations for these component of the media?
    1. 100µl Transferrin
    ². 100µl Putrescine
    3. 100µl Selenium
    4. 100µl Progesterone
    5. 50µl  Insulin
    6. 10µl ²0-Hydroxyecdysone

    Reply
    Posted by: Laura B.
    June 20, 2013 - 12:49 PM
  3. Could you please give the concentrations of the stock solutions used to supplement the media?
    1. 100µl Transferrin
    2. 100µl Putrescine
    3. 100µl Selenium
    4. 100µl Progesterone
    5. 50µl Insulin
    6. 10µl ²0-Hydroxyecdysone

    Thank you in advance for your time!

    Reply
    Posted by: Catarina P.
    March 24, 2014 - 9:31 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics