Geç Stage Drosophila pupa Brain İlköğretim Nöronal Kültürler

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu video, geç dönem Drosophila pupa beyinleri primer nöronal kültürlerin hazırlanmasında gösteriyor. Canlı kültürlerin Görüntüleme Fura-2 kullanarak kalsiyum düzeyleri neurite akıbet ve görüntüleme göstermektedir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sicaeros, B., Campusano, J. M., O'Dowd, D. K. Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae. J. Vis. Exp. (4), e200, doi:10.3791/200 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bu video, geç dönem Drosophila pupa beyinleri primer nöronal kültürlerin hazırlanmasında gösteriyor. Prosedür puparium oluşumundan sonra 70-78 saat hayvanların beyinlerinin kaldırılması ile başlar. Izole beyinleri serum büyüme ortamında birkaç yıkar takip papain kısa inkübasyondan sonra gösterilmiştir. Bir lamel medya 5 ul açılan her bir beyin mekanik ayrılma süreci gösterilmektedir. Post-mitotik nöronların akson ve dendritler disosiasyon sırasında soma yakın sheered ama nöronlar kaplama bir kaç saat içinde süreçleri yeniden başlar. Görüntüler 2 gün canlı kültürler göstermektedir. Nöronlar kültüründe ilk haftasında süreçlerini ayrıntılı olarak devam etmektedir. Spesifik nöronal nüfus, kültür, GFP veya RFP floresan belirteçleri doku belirli bir ifade sürücü GAL4 hatları kullanarak tespit edilebilir. Tüm hücre kayıtları kültürlü nöronların fonksiyonel, kendiliğinden aktif ve GABAerjik kolinerjik sinaps oluşturur göstermiştir. Kısa bir video segment, kültürlü nöronların bir tabak içinde kendiliğinden kalsiyum transientler ve nikotin uyarılmış kalsiyum tepkileri izlemek için bir kalsiyum gösterge boyası olarak Fura-2 kullanarak kültürlü nöronlarda kalsiyum dinamiklerini göstermektedir. Bunlar pupa beyin kültürleri, genetik ve farmakolojik araçları merkezi sinaps oluşumu ve fonksiyonunu etkileyen iç ve dış faktörleri tanımlamak için kullanılabilecek yararlı bir model sistem.

Protocol

Kültür gün önce hazırlıklar:

  1. Steril diseksiyon çözüm olun.
  2. Steril DMEM olun ve 10 ml alikotları tutmak, 4 ° C 2 hafta boyunca.
  3. 1 ay için 50 veya 100 ul alikotları steril DDM2 takviyeleri ve donma olun.
  4. CONA / laminin olun.
  5. Kat lamelleri.
    İsteğe Bağlı: 4 ay kadar donmuş steril Cnbm ve mağaza olun.

Kültür, günü

I. laminer akış kaput Enzim Çözümü (ES) hazırlayın

  1. 5 ml, 15 ml santrifüj tüpüne çözüm diseksiyon (DS) koyun.
  2. 0.6 ml Eppendorf 0.8 mg L-Sistein tartılır ve DS 150 ul ekleyin. Kristaller gidene dek, yukarı ve aşağı Pipet.
  3. 150 ml 5 ml DS DS / Sistein ekleyin ve iyice karıştırın.
  4. 50 U Papain (adet) ekleyin.
  5. 7 ml 0.1 N Na OH ekleyin ve iyice karıştırın. Çözüm 30 dakika içinde açık olacak. aktive edildiğinde.
  6. 0,2 mm steril 1,5 ml vidalı kapaklı mikrofuge'de tüp içine şırınga filtresi ile filtre enzim çözeltisi

    Papain: 5 ml DS 50 U Wanna. Her parti, biraz farklı, bu yüzden ne kadar hesaplamak gerekir:
    37.3 mg / ml ve 28.3 U / mg
    37.3 x 28.3 = 1055,59 U / ml (1000 ml)
    50 U = 47.4 ml

II. DDM2 medya yapın

Kültür, günü: DDM2 yapmak için aşağıdaki takviyeleri eklemek

Için 10 ml DMEM, sadece kültür önce takviyeleri ekleyin:

  1. 100μl Transferrin
  2. 100μl Putrescine
  3. 100μl Selenyum
  4. 100μl Progesteron
  5. 50μl İnsülin
  6. 10μl 20-Hydroxyecdysone

Not: planlanan tüm kültürlerde (her beyin ayrı bir 35 mm Petri kabında tek bir lamel, medya 1.5 ms / kültür kaplama) için yeterli DDM2 olun

Adım III-VI yapılan steril olmayan bir laboratuvar tezgahı ve 45 dakika veya daha kısa sürede tamamlanması gerekmektedir.

III. Pupa Koleksiyonu

  1. Diseksiyon mikroskop altında 10-15 flakon taraftan pupa seçin.
  2. Pupa, kuru bir 35 mm Petri kabında kapak yerleştirin.

Not: Biz genellikle puparium formasyonu (APF) sonra 55-78 saat arasında pupa beyinlerini kullanmak. Neurite akıbet genel düzeyi en eski pupa biraz daha düşük iken baş kapsül, yıkılmaya yüz çünkü genç pupa beyin incelemek için biraz zordur. Canton-S wild tip gerginlik, bu aşamalar, hafif hafif kırmızımsı kahverengi pigmentli gözlerinden başka bir yerde çok az pigment ile tanınır.

IV. Diseksiyon mikroskobu altında Decapitation

  1. Yeri sonraki iki damla steril diseksiyon çözüm Petri kabı kapağı, pupa.
  2. Yavaşça sol elinde ince forseps ile tek bir pupa tutun ve ön pupa sonunda manikür kaldırmak için sağ elinde bir 1 cc şırınga, 27 gauge bir şırınga iğne kullanın.
  3. Forseps ile pupa hafifçe sıkın ve baş çıktığında boyun koparmak için 27 gauge iğne kullanınız.
  4. Iğne ucu veya forseps ile çözüm diseksiyon bırak baş aktarın.
  5. 10-15 baş tek bir damla kadar tekrarlayın.

Diseksiyon mikroskobu altında kafa beyin V. Kaldırma

  1. Her el, 27 gauge iğne ile 1 cc şırınga tutun.
  2. Burnumun siz ve başın dorsal yüzeyi kuzeye bakacak şekilde çözüm diseksiyon açılan sinek kafa pozisyonu kullanın.
  3. Baş aşağı pin ve ventral dorsal yüzeyine gider sağ gözünde bir yarık yapma hakkını saklı iğne kullanmak için burnumun içine sol iğne yerleştirin.
  4. Burnumun bölgede sol yanında doğru bir iğne takın ve sonra beynin sağ gözü yarık doğru iterek manikür, sol gözün üzerine hafifçe bastırmak için sol iğne kullanınız. Genellikle optik lo hem beyin, nispeten bozulmamış, sağda yarık ortaya gerektiğinibes de hala bağlı ve bazen pigmentli göz dokusu.
  5. Beyin, yeni bir steril, 35 mm Petri kabı, steril diseksiyon serum fizyolojik damla iğne ve transfer sırtına doğru itin.
  6. Her genotip için 10-15 beyinleri toplayın.

VI. Kaldırılması, optik loblar ve enzim tedavisi

  1. 27 gauge iğne ile 1 cc şırınga tutun ve her elin tüm beyinleri diseksiyon çözüm açılan küçük bir alanda toplamak için bu
  2. Böylece her bir beyin doku kültürü kalan merkezi beyin bölgesi optik loblar kaldırmak için kesici aletler şırınga kullanın.
  3. 5 ul 20 ul Pipetman, Eppendorf tüpüne 1 ml steril papain çözüm içeren tek bir genotip tüm beyinleri aktarmak için kullanın.
  4. Brain için papain 60 devirde bir rotator seti 10-15 dakika inkübe edildi.
  5. 3000 rpm'de 3 dakika boyunca santrifüjleyin.

Steril laminer akış kaputu İçinde tüm adımları doku havaya maruz kalan adımları için laminer akış kaput yapılmalıdır.

VII. Yıkama

  1. Enzim çözeltisi çıkarın ve steril diseksiyon çözümü ile değiştirin.
  2. 3000 rpm'de 3 dakika boyunca santrifüjleyin.
  3. Steril diseksiyon çözümü ile bir toplam 3 kez yıkayın.
  4. Diseksiyon salin çıkarın ve DDM2 ile değiştirin.
  5. Santrifüj ve DDM2 ile toplam 2 kez yıkayın.
  6. Steril bir 35 mm Petri kabında Transfer beyin ve medya.

VIII. Diseksiyon mikroskobu altında ezerek toz haline getirme ve Kaplama

  1. DDM2 bir lamel merkezinde 5 ul yerleştirin.
  2. Sarı bir ucu ile DDM2 Bu düşüşün 1 beyin aktarın.
  3. Mikroskop altında beyin zar kadar küçük parçalar halinde (<1 dakikada almalıdır), 27 gauge iğne kullanın.
  4. Görsel rehberliği altında, büyük parçalar pipetlemeyin ucu içine yavaşça emilir ve ortama geri sınırdışı böylece iyi bir noktaya çekti damlalıklı cam ucunu kırmak. Biz 100 ul hematokrit kapiller cam ile standart olarak gelir ağız emme boruları kullanın.

    Not: medya kabarcıkları almak için özen ve kullanmak için en iyi boyutu pipetlemeyin ampirik olarak belirlemek gerekir. İyi olanlar, yaklaşık 30 saniye / beyin, bazı bireysel hücrelerin ve hala bazı büyük öbekler beyin ayırmak izin verir. Yüksek güçte bu baktığınızda, nöronların yaklaşık% 10-20 hala kalan bazı işlemler var ve hala bazı büyük öbekler olacak. Çok ayrıştırmaları varsa, o zaman tüm hücreleri yuvarlak olacak ve onlar hayatta olmaz bu kadar zarar görmüş olacak. Bu adım, uygulama alır ve hızlı bir şekilde değiştirebilirsiniz büyük bir yüzey-hacim oranı ve DDM2 açılan osmolalitesi ve pH olmadığından hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Doku, mümkün olduğunca çabuk CO 2 inkübatör yerleştirilmesi gerekiyor .

  5. "Genotip, tarih ve saat": petri kapak yaz.
  6. , 100 mm petri, 35 mm petri (ıslak kimwipe) koyun ve 30 dakika CO 2 inkübatör yerleşmek izin .
  7. DDM2 1.5 ml 35 mm tabak Sel.
  8. % 5 CO 2 inkübatör (23 ° C) inkübatör kültürleri tutun.

    Not: Eğer bir soğutma CO 2 inkübatör erişim yoksa, standart bir memeli doku kültürü inkübatör kullanımı ve serin bir odada ve ısı 23 ya koymak ° C veya laboratuarda koymak, geçici kapatmak ve kullanmak kuluçka altındaki ortam etrafında düzenleyen geçici bir tepsi buz.

IX. Besleme Hücreler

  1. CNBM/B27: 1 Gün (ertesi gün), 03:01 DDM2 yapmak CNBM/B27 0.5 ml (Şartlandırılmış Medya) eklemek.
  2. CNBM/B27: Günlük 5 03:01 DDM2 için 1 ml medya değiştirin.
  3. CNBM/B27 her 4-5 gün: 03:01 DDM2 besleyen hücrelerin tutun.

    Not: Kültürleri nöronal olmayan klimalı medya olmadan yetiştirilir ama nöronlar biraz daha kırılgan görünür ve elektrofizyoloji deneylerde kullanılmak için daha zor olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Neurites uzatmak ve fonksiyonel sinaptik bağlantıları oluşturmak embriyonik / postnatal kemirgenler beyinleri hasat nöronlar primer hücre kültürü yetiştirilebilir. Bu kültürlerin hazırlanması için Yöntemleri iyi kurulmuş ve kemirgen nöronal kültürlerin çalışmalar, sinaps oluşumu ve işlevi düzenlenmesi (Banker ve Goslin, 1991) yer alan genler ve çevresel faktörlerin belirlenmesi kritik bir rol oynamıştır. Türlerin çeşitli böcek nöron kültüründe yetişen olabilir, fonksiyonel kültür sinaptik bağlantıları oluşturmak için gösterilen tek böcek nöronlar Drosophila (Rohrbough ve ark, 2003). Neuroblasts tanımlı medya yetişen orta gastrula evresi Drosophila embriyolar elektriksel olarak uyarılabilen ve form fonksiyonel, internöronal sinaptik bağlantıları (Lee ve O'Dowd, 1999 O'Dowd, 1995) nöronlar doğuran hasat. Faktörleri belirlemek için sinaptik formu ve geç dönem Drosophila (Su ve O'Dowd, 2003) beyinleri hasat ve kültür nöronlar için bu videoyu gösterildiği tekniğini geliştirdi yetişkin davranışları arabuluculuk rolü olduğu bilinen nöronların fonksiyonu düzenler. Bu prosedürün önemli özelliklerinden biri, kollajenaz veya geleneksel böcek nöronal kültürlerin hazırlanmasında kullanılan diğer sert enzimlerin yerine papain, kullanımı idi. Hayatta kısa aksonal süreçleri istinat ayrışmış nöronlar Papain sonuçları, nöritik süreçleri yeniden ve işlevsel internöronal sinaptik bağlantıları formu. Tüm kayıtları, mantar vücut Kenyon hücreleri de dahil olmak üzere tespit edilen hücre popülasyonlarının inhibisyonu GABA reseptörleri (Su ve O'Dowd, 2003) aracılı ise kültürlerin hızlı eksitatör sinaptik iletim nAChRs aracılık ettiğini göstermektedir. En son elektron mikroskopik analiz göstermektedir ki, yetişkin bir beynin kimyasal ve elektriksel sinaps (Oh et al, 2007) hem de benzer yapısal özellikleri ile kültür formu sinapslar nöronların. Videoda gösterildiği gibi, kültürlerin de Fura-2 kalsiyum görüntüleme çalışmaları için uygun ve Kenyon hücreleri ve kolinerjik nöronlar (Jiang ve ark. Dahil olmak üzere tespit edilen hücre popülasyonlarının hücre içi kalsiyum düzeyleri spontan ve uyarılmış değişiklikler altta yatan hücresel mekanizmaları araştırmak için bu kullanmış diğerleri, 2005; Campusano ve ark, 2007). Drosophila mevcut geniş genetik araç kiti ile bu kültür merkezi sinaps yapı, fonksiyon ve plastisite içsel ve dışsal düzenleyiciler tanımlamak için çok yararlı bir araç sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, hibe NS27501 tarafından desteklenen DKOD. Bu iş için ek destek, DKOD HHMI Profesör Programı aracılığıyla destek UC Irvine hibe sağlanmıştır.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Concanavalin A Sigma-Aldrich C-2010 To 2.5 ml DS, add 25 mg Concanavalin A bottle. This is 10 mg/ml concentration.Make aliquots of 90 ul and store at -20 C, no longer than 3 months.
Laminin Sigma-Aldrich L-2020 Add 1ml DS to 1mg Laminin bottle. This is 0.5 mg/ml concentration.Make aliquots of 10 ul and store at -20 C, no longer than 3 months.
Coverslips Bellco Glass 1943-00012 12 mm glass coverslips
ConA + Laminin solution Stock solution, from Con A stock and laminin stock, for coverslip coating: Add in 5 ml DS, 83.5 ul of ConA (167 ug/ml) and 8.35 ul of Laminin (0.835 ug/ml). Mix.Make aliquots of 100 ul and store at -20 C, not longer than a month.
Dissecting Solution Buffer For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C.
Dissecting Solution Buffer For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C.
Solution B: HEPES Buffer Sigma-Aldrich H-3375 20.97g (9.9mM). Add ultra filtered water up to 200 ml. Mix until dissolve and bring final volume to 250 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution B" and store at 4 C.
Solution A Buffer For 500 ml: 80.0g (137 mM) NaCl (Sigma S-9625) + 4.0g (5.4mM) KCl (Sigma P-4504) + 0.24g (0.17mM) Na2HPO4 (Sigma S-0876) + 0.3g (0.22 mM) KH2PO4 (Sigma P-5379).Weigh out all ingredients and mix until dissolved with 400 ml ultra filtered water. Bring final volume to 500 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution A" and store at 4°C.
Coating Coverslips:Put autoclaved coverslips in a 60 mm petri dish.Pipet 5 ul of Con A/Laminin mix onto center of each coverslip.Place in 37 C incubator for 2 hours.Rinse 3x coverslips with 100 ul of autoclaved water each. Use vacuum attached to a sterile Pasteur pipet.During the last rinse, pick up the coverslip with forceps and dry both sides.Transfer the coverslip to a 35mm Petri dish.Store at room temperature for up to a month.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. MIT Press. Cambridge. (1991).
  2. Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and Modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System. J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).
  3. O'Dowd, D. K. Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium. J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).
  4. Lee, D., O'Dowd, D. K. Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons. J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).
  5. Su, H., O'Dowd, D. K. Fast synaptic currents in Drosophila mushroom body Kenyon cells are mediated by alpha-bungarotoxin-sensitive nAChRs and picrotoxin-sensitive GABA receptors. J. Neurosci. 23, 9246-9253 (2003).
  6. Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels. J. Neurophysiol. 94, 491-500 (2005).
  7. Campusano, J. M., Su, H., Jiang, S. A., Sicaeros, B., O'Dowd, D. K. nAChR-mediated calcium responses and plasticity in Drosophila Kenyon cells. Develop Neurobiol. 67, 1520-1532 (2007).
  8. Oh, H. -W., Campusano, J. M., Hilgenberg, L. G. W., Sun, X., Smith, M. A., O'Dowd, D. K. Ultrastructural analysis of chemical synapses and gap junctions between Drosophila brain neurons in culture. Develop Neurobiol. (2007).

Comments

4 Comments

  1. Why are you using CO² incubator if these are insect cells and not mammalian?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 24, 2008 - 1:20 PM
  2. Could you please give the concentrations for these component of the media?
    1. 100µl Transferrin
    ². 100µl Putrescine
    3. 100µl Selenium
    4. 100µl Progesterone
    5. 50µl  Insulin
    6. 10µl ²0-Hydroxyecdysone

    Reply
    Posted by: Laura B.
    June 20, 2013 - 12:49 PM
  3. Could you please give the concentrations of the stock solutions used to supplement the media?
    1. 100µl Transferrin
    2. 100µl Putrescine
    3. 100µl Selenium
    4. 100µl Progesterone
    5. 50µl Insulin
    6. 10µl ²0-Hydroxyecdysone

    Thank you in advance for your time!

    Reply
    Posted by: Catarina P.
    March 24, 2014 - 9:31 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics