宏基因组库的大型屏幕

Biology

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Pham, V. D., Palden, T., DeLong, E. F. Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries. J. Vis. Exp. (4), e201, doi:10.3791/201 (2007).

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Abstract

宏基因组库存档的连续,而无需事先培养的微生物基因组序列的大片段。生成一个简化程序,用于创建和筛选宏基因组库,因此可用于高效高通量为未培养微生物组合的遗传和代谢性质的调查。在这里,关键协议的视频,这是我们提出的是最有用的格式,为准确地描述一个长期的过程,交替取决于机器人仪器和(人类)人工干预。首先,我们采用机器人当场库中克隆到高密度macroarray膜,每一个都可以从二十四384库板包含重复的殖民地。自动化是至关重要,这不仅对精度和速度的程序,但也由于规模,以适应高密度的空间安排大量的库克隆小型化。一旦产生,接下来我们演示了如何macroarray膜可用于使用探针标记,杂交膜,和信号检测的标准协议修改后的版本利益的基因筛选。我们补充了这些程序的详细的书面说明所涉及的步骤和所需材料,所有这一切都是在网上提供视频一起的视觉示范。

Protocol

1。杂交过程

一个杂交管会采取1或2的膜(22厘米大小22)。使用杂交液50毫升和0.5毫克每杂交管的DNA探针(10 ng / ml的终浓度)。为了达到最佳效果,请使用凝胶纯化的DNA为探针。如果缩放了探针的制备,管数量的增加,而不是增加每管中的试剂量。

探针制备(0.5毫克DNA):

  1. 60μL水稀释15μL交联剂的解决方案。
  2. 稀的DNA为10 ng /μL水,一个螺丝帽微管的总体积50μL。
  3. 变性的DNA在沸水中5分钟。
  4. 迅速转移到冰,凉5分钟,让。自旋简要。
  5. 加入50μL反应缓冲液,轻轻混匀。
  6. 加入10μL的标签试剂,轻轻混匀。
  7. 加入50μL的稀释交联剂从第1步的解决方案,并轻轻混匀。涡轻轻旋转简要。
  8. 在37 ° C下30分钟。
  9. 长达2小时,或置于冰上,添加100%的甘油并储存在-20 ° C的量相等

    注意:使用该工具包提供的水。除另有注明外,所有试剂置于冰上

膜的制备及杂交

  1. 杂交缓冲液和杂交管预热50毫升至60 ° C。
  2. 杂交缓冲液中加入杂交管。卷膜(S),并添加到杂交管。 (如果每管加入2膜,第一滚了一膜完全,然后卷起在同一方向的其他膜在上面。)
  3. 孵育杂交管,在60 ° C为至少半小时(请务必得到彻底浸透膜(S)。)
  4. 传输用长吸管从杂交管的试管中探针的杂交缓冲液中约1毫升。涡轻轻旋转简要。传输混合杂交管。
  5. 孵育60℃过夜。

    注:处理膜时使用产钳和手套。混合杂交管的内容,轻轻的,因为过多的搅拌会造成不良的泡沫永久性的形成。 应加膜在潮湿的条件下,浸泡在杂交缓冲液中或水,如果必要的和多余的液体排出之前加入。

2。检测过程

洗膜

  1. 主要洗涤缓冲液预热至60 ° C (使用微波炉和/或加热板)。
  2. 如果有一个杂交管膜,一膜转移到一个干净,预热,空的杂交管。
  3. 简要初级洗涤缓冲液约50毫升冲洗杂交管。
  4. 加入约100毫升的主要缓冲液洗杂交管和孵育60 ° C为10分钟。
  5. 重复步骤3和4。
  6. 转印膜洗涤容器在室温下孵育至少250毫升二级缓冲液洗为5分钟。
  7. 重复步骤6。

    注:膜可在二次洗涤缓冲液在室温下保持信号产生前半h。

信号生成和检测(一膜议事)

  1. 带两件到桌面上(步骤2和步骤4)SaranWrap平。
  2. 从膜小心流掉多余的缓冲区通过触摸容器的一侧对膜的角落,并转移到SaranWrap(样品的一面朝上)膜。
  3. 通过膜和膜倍保鲜膜,倒入6-7毫升的ECF试剂。小心地分布在膜的ECF试剂,轻轻移动在SaranWrap Kimwipe。孵育5分钟。
  4. 从膜流掉多余的ECF试剂,并转移到新的SaranWrap,超过膜折叠包装,并用胶带密封的边缘。盖用铝箔膜。孵育1-2小时。
  5. 准备扫描仪玻璃板,由分布在玻璃板1-2毫升的ECF试剂。然后转移到玻璃膜板(样品的一面朝下),并分发环境及自然保育基金试剂,在膜的另一1-2毫升。覆盖SaranWrap和认真推动所有气泡远离膜。 (你可以放置一个SaranWrap顶部僵板,以保持对玻璃板压的膜)。
  6. 使用富士FLA - 5100荧光以下设置扫描仪(“1 1激光图像”模式):473 nm的激发,检测过滤液体聚丁二烯(510纳米),分辨率为50微米,16位信号毕业,通道1 400 V(扫描需要约15-20每22厘米大小的膜22分钟)。

    可选:

  7. 让我们坐2-4小时(或更长)。
  8. 在第6步重复扫描。

3。剥离和存储过程(NUF版本)

  1. 转印膜100%等hanol并在室温下孵育10分钟,轻轻摇动。
  2. 更换新鲜的100%的乙醇,并在室温下孵育过夜。 (膜“可能会持续数天。乙醇)
  3. 更换乙醇和蒸馏水在室温下孵育10分钟。
  4. 加入100毫升水,5毫升10%的SDS(最终0.5%SDS)杂交管,轻轻混匀。添加膜。
  5. 在80℃孵育1小时
  6. 膜转移到一个干净的,空的容器。
  7. 加入500毫升水,10%SDS(最终0.1%SDS)5毫升的烧杯和热量,在微波炉的大力熬。
  8. 倒在膜近沸的0.1%SDS溶液,轻轻搅拌几分钟。允许冷却到室温。
  9. 在至少250毫升的无菌100毫米的Tris pH值8冲洗至少10分钟。
  10. 裹膜在SaranWrap和磁带的精心密切的边缘。保存在4 ° C。膜(绝干出来的。)

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Discussion

剥离的过程并没有得到优化。然而,在剥离过程中制造商的指示(2洗,100%的乙醇10分钟,1小时1洗在60 ° C的0.5%SDS)是不够的。孵育过夜至少在100%的乙醇是必要的,解散的ECF反应产物;几天出现在100%的乙醇孵化有能力重新探测膜没有不利的影响。制造商的SDS治疗也似乎是不够的。 NUF已试图在1小时80 ° C,0.5%SDS近沸腾的0.1%SDS成功治疗。麦蒂已经浇过近沸的0.1%SDS,一次就足够了。

帮助提示:
杂交缓冲液中,杂交管,和初级洗涤缓冲液必须预热至60 ° C前使用,必须保持在该温度下,在整个实验过程。例如,保持在一个沉浸温度计加热板的缓冲区;康宁加热板,设置了约3个结果,在60 ° C。

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
AlkPhos Direct Labelling Reagents kit Amersham RPN3680 Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C.
ECF Substrate kit Amersham RPN3685 Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer.Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm).
20x Secondary Wash Buffer buffer 121 g Tris(final 1 M), 117 g NaCl(final 2 M).Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months.
0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7 buffer 69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature.
1 M MgCl2 50.8 g MgCl2.6H2OAdjust to 250 ml with water. Store at room temperature.
10% (w/v) SDS 20 g SDSAdjust to 200 ml with water. Store at room temperatur
Combination pack RPN3692 = RPN3680 + RPN3685

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Comments

1 Comment

  1. whats the success rate?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 14, 2010 - 1:26 AM

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