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Biology

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Pham, V. D., Palden, T., DeLong, E. F. Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries. J. Vis. Exp. (4), e201, doi:10.3791/201 (2007).

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Abstract

이전 경작하지 않고 미생물의 게놈 시퀀스의 연속 Metagenomic 라이브러리 아카이브 큰 조각. metagenomic 라이브러리를 생성하고 검사를위한 간소화된 절차를 생성하는 것은 미개한 미생물 assemblages의 유전과 신진 대사 특성에 효율적으로 높은 처리량을 수사 따라서 유용합니다. 여기, 주요 프로토콜은 우리가 정확하게 교대 로봇 계측과 (인간) 수동 개입에 따라 긴 프로세스를 설명하기위한 가장 유용한 형식입니다 제안 비디오에 제공됩니다. 첫째, 우리는 스물네 384 자 도서관 접시에서 중복 식민지를 포함할 수 있습니다 각각의 고밀도 macroarray의 점막에 라이브러리 클론을 지점으로 로봇을 고용. 자동화는 또한 매우 치밀한 공간 준비로 도서관 클론의 다수에 맞게 필요한 규모의 소형화에 의해뿐만 아니라 정확성과 속도에 대해이 절차를 위해 필수적입니다,하지만. 일단 생성, 우리는 다음 macroarray의 점막이 프로브 라벨, 멤브레인 하이브리드화, 및 신호 감지를위한 표준 프로토콜의 수정된 버전을 사용하여 관심있는 유전자에 대한 검사를 할 수있는 방법을 보여주었다. 우리는 비디오와 함께 온라인으로 제공되는 모든하는 상세한 서면 관련된 단계에 대한 설명과 필요한 자료와 절차의 시각 데모를 보완.

Protocol

1. 하이브 리다이 제이션 절차

하나의 하이브리드화 관은 1 또는 2 세포막을 (22cm로 크기가 22) 소요됩니다. 하이브 리다이 제이션 혼합물의 50 ML 및 하이브리드화 관 당 DNA 프로브 (10 NG / ML 최종 농도) 0.5 MG를 사용하십시오. 최상의 결과를 얻으려면, 프로브로 젤 - 정화 DNA를 사용합니다. 프로브 준비 최대 배율 경우, 튜브의 개수보다는 튜브 당 시약의 양을 증가를 향상시킬 수 있습니다.

프로브 준비 (0.5 MG DNA) :

  1. 물 60 μl와 가교제 용액 15 μl를 희석.
  2. DNA 10 NG / 나사 덮인 microtube에 50 μl 전체 볼륨에 물을 μl를 희석.
  3. 끓는 물에 5 분 변성의 DNA.
  4. 신속하게 얼음을 전송하고 5 분 식지. 간단히 스핀.
  5. 반응 완충액 50 μl를 추가하고 부드럽게 섞는다.
  6. 시약 라벨 10 μl를 추가하고 부드럽게 섞는다.
  7. 1 단계의 희석 가교제 용액 50 μl를 추가하고 부드럽게 섞는다. 부드럽게 소용돌이와 짧게 스핀.
  8. 37 ° C 30 분 알을 품다.
  9. 최대 2 H 위해 얼음에 보관 또는 -20 ° C. 100 %의 글리세롤과 저장소의 동일한 음량을 추가

    참고 : 키트와 함께 제공된 물을 사용하십시오. 달리 명시되지 않는 한 얼음의 모든 시약 보관하십시오.

막 준비와 하이브리드화

  1. 60 하이브 리다이 제이션 버퍼와 하이브리드화 관 앞서 열을 가하다 50 ML은 ° C.
  2. 하이브리드화 튜브에 하이브리드화 버퍼를 추가합니다. 멤브레인 (S)을 올리고 하이브리드화 튜브에 추가합니다. (튜브 당 두 세포막, 완벽 한 멤브레인 첫번째 롤을 추가한다면, 같은 방향으로 상단에있는 다른 멤브레인을 롤.)
  3. 60 하이브 리다이 제이션 튜브를 품어 ° 이상에 대한 C ½ H. (멤브레인 (S)가 완전히 젖었을 확인하십시오.)
  4. 하이브 리다이 제이션 관에서 라벨 프로브를 포함하는 튜브에 긴 피펫과 하이브리드화 버퍼의 약 1 ML을 전송합니다. 부드럽게 소용돌이와 짧게 스핀. 하이브 리다이 제이션 튜브로 혼합물을 전송합니다.
  5. ° C 하루 60 알을 품다.

    참고 : 사용 포셉 및 장갑 세포막을 취급. 하이브리드화 튜브의 혼합 내용을 부드럽게하기 때문에 너무 많은 동요가 원하지 않는 거품의 영구적인 형성을 초래하게됩니다. 세포막은 서부 유럽 표준시 조건에 추가되어야, 하이브 리다이 제이션 버퍼 또는 물 필요한 경우에 담그다 및 추가하기 전에 여분의 액체를 배수.

2. 검색 절차

워싱 세포막

  1. 60 ° C.에 앞서 열을 가하다 주 세척 버퍼 (전자렌지 및 / 또는 열판을 사용합니다.)
  2. 한 하이브리드화 튜브 2 점막이있다면, 깨끗하고, preheated, 빈 하이브리드화 관 한 멤브레인을 전송하기만하면됩니다.
  3. 간단히 차 세척 버퍼의 약 50 ML과 하이브리드화 튜브를 헹굴.
  4. 60 하이브리드화 튜브와 부화 ° 10 분 C로 기본 세척 버퍼의 약 100 ML을 추가합니다.
  5. 3, 4 단계를 반복합니다.
  6. 5 분 실온에서 차 세척 버퍼 최소한 250 ML과 컨테이너와 부화를 세탁하기 위해 막을 전송.
  7. 6 단계를 반복합니다.

    참고 : 점막이 신호 생성하기 전에 ½ H로 최대 상온에서 보조 씻어 버퍼에 보관 수 있습니다.

신호 생성 및 검출 (한 막 절차)

  1. 탁상에 SaranWrap 평면의 테이프 두 조각 (2 단계에 대해 하나와 4 단계에 대해 하나).
  2. 조심스럽게 용기의 측면에 대한 막의 모서리를 만져 멤브레인에서 여분의 버퍼를 분출과 SaranWrap (최대 샘플 사이드)에 멤브레인를 전송합니다.
  3. 막 이상의 막, 접이식 비닐랩을 통해 ECF 시약의 6-7 ML 하거라. 조심스럽게 부드럽게 SaranWrap 통해 Kimwipe를 이동하여 막 이상 ECF 시약을 배포합니다. 5 분 알을 품다.
  4. 멤브레인에서 초과 ECF 시약을 드레인과 새로운 SaranWrap, 멤브레인 위에 접어 버리고,에 그것을 전송하고 테이프로 가장자리를 밀봉. 알루미늄 호일로 멤브레인 표지. 1-2시간을위한 부화.
  5. 유리 접시 이상의 ECF 시약 1-2 ML을 배포하여 스캐너 유리 플레이트를 준비합니다. 그런 다음 유리 플레이트 (아래 샘플 사이드)에 멤브레인를 전송하고 멤브레인 이상 ECF 시약의 또 다른 1-2 ML을 배포합니다. SaranWrap와 오버레이 조심스럽게 거리 멤브레인에서 공기 방울을 밀어. (당신은 유리 플레이트에 대한 누르면 막을 유지 SaranWrap 위에 성실히 접시를 배치할 수 있습니다.)
  6. 여기 473 NM, 탐지 필터 LPB (510 NM), 해상도 50 μm의, 16 비트 신호를 졸업, CH1 400 V. (스캔 다음 설정으로 후지 FLA - 5100 형광 스캐너 ( "1 레이저 한 이미지"모드)를 사용 22cm의 크기는 22 멤브레인 당 약 15-20 분 정도 소요됩니다.)

    옵션 :

  7. 2~4시간 (이상)에 앉아 보자.
  8. 6 단계 같이 스캔 반복합니다.

3. (NUF 버전) 스트립과 절차를 저장할

  1. 백퍼센트 동부 표준시로 막을 전송부드러운 교반 10 분 실온에서 hanol와 부화.
  2. 신선한 100 % 에탄올로 대체하고 실온에서 하룻밤 품어. (분리막은 며칠 동안 에탄올에 남아있을 수 있습니다.)
  3. 증류수와 에탄올로 교체 10 분 실온에서 알을 품다.
  4. SDS (최종 0.5 % SDS) 하이브리드화 튜브 100 ML 물 10 % 5 ML을 추가하고 부드럽게 섞는다. 멤브레인를 추가합니다.
  5. 80 ° C 1 H.위한 부화
  6. 깨끗한 빈 컨테이너로 막은을 전송.
  7. 10% SDS 500 ML 물 5 ML (최종 0.1 % SDS)을 전자렌지에 활발한 끓일 수있는 비커와 열을 추가합니다.
  8. 멤브레인 위에 가까운 끓는 0.1 % SDS 용액을 붓고 부드럽게 몇 분 동안 선동. 실온으로 냉각하도록 허용합니다.
  9. 적어도 10 분 멸균 100 MM 트리스 산도 8 적어도 250 ML에 씻어.
  10. 랩 SaranWrap에 막과 테이프로 조심스럽게 닫습니다 가장자리. 4 스토어 ° C. (세포막 밖으로 건조 절대 필요합니다.)

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Discussion

스트립 절차는 최적화되지 않았습니다. 그러나, 제조 업체의 지침 (2 세척 각각 100 % 에탄올에 10 분, 60 ° C 0.5 %의 SDS 1 H 1 씻어)에 주어진 스트립 절차가 부족합니다. 100 % 에탄올에 적어도 하룻밤 배양은 ECF의 반응 생성물을 분해하는 데 필요한, ​​100 % 에탄올에 며칠 보육은 막을 reprobe 수있는 능력에 아무런 악영향이없는 것으로 나타납니다. 제조 업체의 SDS 치료도 부족 것으로 보인다. NUF 80 1 H를 시도했다 ° C 0.5 % SDS는 성공에 가까운 끓는 0.1 % SDS 한 치료를 다음과. 트레이시 한 시간이 거의 끓는 0.1 % SDS로 오버 붓는 것은 충분 것으로 나타났습니다.

유용한 힌트 :
하이브 리다이 제이션 버퍼, 하이브리드화 튜브, 세척 및 기본 버퍼는 60 preheated해야 ° C 사전을 사용하고, 실험을하는 동안 그 온도에서 보관해야합니다. 예를 들어, 포장되어 온도계와 열판에 버퍼를 유지, 코닝 열판, 60 약 3 결과의 설정 ° C.에

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
AlkPhos Direct Labelling Reagents kit Amersham RPN3680 Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C.
ECF Substrate kit Amersham RPN3685 Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer.Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm).
20x Secondary Wash Buffer buffer 121 g Tris(final 1 M), 117 g NaCl(final 2 M).Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months.
0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7 buffer 69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature.
1 M MgCl2 50.8 g MgCl2.6H2OAdjust to 250 ml with water. Store at room temperature.
10% (w/v) SDS 20 g SDSAdjust to 200 ml with water. Store at room temperatur
Combination pack RPN3692 = RPN3680 + RPN3685

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Comments

1 Comment

  1. whats the success rate?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 14, 2010 - 1:26 AM

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